Kompleti i imuno-analizimit enzimë konkurrues për analizën sasiore të tylosinës
Kompleti imuno-analizues enzimë konkurrues për
Analiza sasiore eTylosin
1. Sfondi
Tylosinështë një antibiotik makrolid, i cili përdoret kryesisht si antibakterial dhe anti-mikoplazmatik.MRL të rrepta janë krijuar pasi ky medikament mund të çojë në efekte anësore serioze në grupe të caktuara.
Ky komplet është një produkt i ri i bazuar në teknologjinë ELISA, i cili është i shpejtë, i lehtë, i saktë dhe i ndjeshëm në krahasim me analizat e zakonshme instrumentale dhe i nevojiten vetëm 1.5 orë në një operacion, ai mund të minimizojë ndjeshëm gabimet e funksionimit dhe intensitetin e punës.
2. Parimi i testit
Ky komplet bazohet në teknologjinë ELISA konkurruese indirekte.Puset e mikrotitrit janë të veshura me antigjen bashkues.Mbetja e tilosinës në kampion konkurron me antigjenin e veshur në pllakën e mikrotitrit për antitrupin.Pas shtimit të antitrupave të etiketuara me enzimë, substrati TMB përdoret për të treguar ngjyrën.Absorbimi i kampionit lidhet negativisht me përmbajtjen e tilozinës në të, pasi të krahasohet me Kurbën Standarde, shumëzuar me faktorin e hollimit, mund të llogaritet sasia e mbetjes së tilozinës në kampion.
3. Aplikacionet
Ky komplet mund të përdoret në analizat sasiore dhe cilësore të mbetjeve të tilosinës në indet e kafshëve (pulë, derri, rosë) dhe qumësht, mjaltë, vezë, etj.
4. Reaksionet e kryqëzuara
Tylosin……………………………………………..100%
Tilmicosin…………………………………………<2%
5. Materialet e nevojshme
5.1 Pajisjet:
----Sspektrofotometri i pllakës së mikrotitorit (450nm/630nm)
----Avullues rrotullues ose instrumente për tharjen e azotit
----homogjenizues
----Tundësi
----Centrifuge
----Bilanci analitik (induktiviteti: 0.01g)
----Pipetë e diplomuar: 10ml
---- Llambë me pipetë gome
---- Balonë vëllimore: 10ml
----Tuba centrifuge polistiren: 50ml
----Mikropipetat: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml-multipipete
5.2 Reagentët:
----Hidroksid natriumi (NaOH, AR)
---- Bikarbonat natriumi (NaHCO3,AR)
---- Karbonat natriumi (NaCO3, AR)
----Acidi trikloroacetik (AR)
---- Acetonitril (AR)
----Acetat etilik (AR)
┅┅n-Heksan (AR)
----Ujë i dejonizuar
6. Komponentët e kompletit
l Pllakë mikrotiter me 96 puse të veshura me antigjen
l Solucione standarde (5 shishe, 1 ml/shishe)
0ppb, 0,5ppb, 1,5ppb, 4,5ppb, 13,5ppb
l Kontroll standard i spikut: (1ml/shishe)1 ppm
l Konjugat enzimë 1ml……………..…………kapak i kuq
l Tretësirë antitrupash 7ml…………………………kapak jeshil
l Tretësirë A 7ml……………………….………kapak i bardhë
l Tretësirë B 7ml…………………………………..kapak i kuq
l Tretësirë ndaluese 7 ml.………………………….kapak i verdhë
l 20×solucion larës i koncentruar 40ml
……………………………………………kapak transparent
l 4×tretësirë ekstraktuese e koncentruar 50ml
………………………………………………….kapelë blu
7. Përgatitja e reagentëve:
Zgjidhja 1:0.1mol/L tretësirë NaOH
Peshoni 0,4 g NaOH në 100 ml ujë të dejonizuar dhe përzieni plotësisht.
Zgjidhja 2: 1mol/L tretësirë NaOH
Peshoni 4 g NaOH në 100 ml ujë të dejonizuar dhe përzieni plotësisht.
Zgjidhja 3: Kripë tampon karbonat
Zgjidhje1: 0.2 M PB
Shpërndani 51,6 g Na2HPO4· 12 orë2O, 8,7 g NaH2PO4· 2H2O me ujë të dejonizuar dhe holluar në 1000 ml.
Zgjidhje2: Zgjidhja e nxjerrjes
Holloni tretësirën e ekstraktimit 2× të koncentruar me ujë të dejonizuar në raportin vëllimor 1:1 (p.sh. 10ml tretësirë 2×ekstraksioni + 10ml ujë të deionizuar), i cili do të përdoret për nxjerrjen e mostrës,kjo zgjidhje mund të ruhet në 4℃ për 1 muaj.
Zgjidhje3: Tretësira e larjes
Hollojeni tretësirën e larjes 20× të koncentruar me ujë të dejonizuar në raportin vëllimor 1:19 (p.sh. 5ml tretësirë 20×larë + 95ml ujë të dejonizuar), i cili do të përdoret për larjen e pjatave.Kjo tretësirë mund të ruhet në 4℃ për 1 muaj.
8. Përgatitjet e mostrave
8.1 Njoftimi dhe masat paraprake para përdorimit:
(a) Ju lutemi përdorni këshilla një herë në procesin e eksperimentit dhe ndryshoni majat kur thithni reagentë të ndryshëm.
(b) Sigurohuni që të gjitha instrumentet të jenë të pastra.
(c) Mbajeni mostrën e indeve në ngrirje.
(d) Mostra e përgatitur duhet të përdoret për analizë menjëherë.
8.2 Indet e kafshëve (pule, derri, etj)
----Homogjenizimi i kampionit me homogjenizues;
----Merrni 2,0±0,05 g homogjenat në një tub centrifuge polistireni 50 ml;shtoni 2 ml 0.2 M PB (zgjidhje1), tundeni për t'u tretur dhe më pas shtoni 8 ml acetat etilik dhe tundeni fort për 3 minuta;
----Centrifuga për ndarje: 3000g/temperatura e ambientit/5min.
----Transferoni 4 ml të fazës organike supernatante në një tub qelqi 10 ml, thajeni me një banjë uji 50-60℃ nën rrymë gazi azotik;
----Të mbeturinat e thata shpërndahen me 1 ml n-heksan, vorbullohen për 30 sekonda për t'u tretur dhe më pas shtoni 1 ml tretësirë ekstraktuese (zgjidhje2), vorbull për 1 min.centrifugë për ndarje: 3000g/temperatura e ambientit/5min
----Hiqni fazen supernatante n-heksan;merrni 50 μl të fazës ujore të substratit për analizë.
Faktori i hollimit: 1
8.2 Qumësht
----Merrni 100μl mostër qumështi të papërpunuar, përzieni me 900μl tretësirë ekstraktuese (zgjidhje2) dhe përzieni plotësisht.
----Merrni 50μl të tretësirës së përgatitur për analizë.
Faktori i hollimit: 10
9. Procesi i analizës
9.1 Njoftim përpara analizës
9.1.1Sigurohuni që të gjithë reagentët dhe mikropuset të jenë të gjithë në temperaturën e dhomës (20-25℃).
9.1.2Kthejini të gjithë reagentët e mbetur në 2-8℃menjëherë pas përdorimit.
9.1.3Larja e saktë e mikropuseve është një hap i rëndësishëm në procesin e analizës;është faktori jetik për riprodhueshmërinë e analizës ELISA.
9.1.4 Azbrazni dritën dhe mbuloni mikropuset gjatë inkubimit.
9.2 Hapat e analizës
9.2.1 Hiqini të gjithë reagentët në temperaturën e dhomës (20-25℃) për më shumë se 30 minuta, shkundni butësisht përpara përdorimit.
9.2.2 Hiqni mikropusetat e nevojshme dhe kthejeni pjesën tjetër në çantën me zinxhir në 2-8℃ menjëherë.
9.2.3 Tretësira e holluar e larjes duhet të ngrohet sërish për të qenë në temperaturën e dhomës përpara përdorimit.
9.2.4Numri:Të numëruara çdo pozicion mikropusi dhe të gjitha standardet dhe mostrat duhet të ekzekutohen në dublikatë.Regjistroni standardet dhe pozicionet e mostrave.
9.2.5Add tretësirë/kampion standard dhe tretësirë antitrupash: Shtoni 50 μl tretësirë standarde ((komplet i ofruar)) ose kampion i përgatitur në puset përkatëse.Shtoni 50 μl tretësirë antitrupash (komplet i ofruar).Përzieni butësisht duke tundur pjatën me dorë dhe inkuboni për 30 minuta në 37℃ me kapak.
9.2.6Lani: Hiqeni butësisht kapakun dhe pastroni lëngun nga pusetat dhe shpëlajini mikropuset me 250µl tretësirë larës të holluar (zgjidhje3) në interval prej 10 sekondash për 4-5 herë.Përthithni ujin e mbetur me letër thithëse (flluska e mbetur e ajrit mund të eliminohet me majë të papërdorur).
9.2.7Shtoni konjugatin e enzimës: Shtoni 100 ml tretësirë të konjuguar enzimë (komplet i ofruar) në çdo pus, përzieni butësisht dhe inkuboni për 30 minuta në 37℃ me kapak.Përsëriteni përsëri hapin e larjes.
9.2.8Ngjyrosje: Shtoni 50µl tretësirë A(komplet i ofruar) dhe 50 μl tretësirë B(komplet i ofruar) për çdo pus.Përzieni butësisht dhe inkuboni për 15 minuta në 37℃ me kapak.
9.2.9Masa: Shtoni 50 μl tretësirë ndaluese (komplet i ofruar) për çdo pus.Përziejini butësisht dhe matni absorbimin në 450 nm (Sigjerohet të matni me gjatësinë e valës së dyfishtë 450/630 nm. Lexoni rezultatin brenda 5 minutash pas shtimit të tretësirës ndaluese).
10. Rezultatet
10.1 Përqindja e absorbimit
Vlerat mesatare të vlerave të absorbimit të marra për standardet dhe mostrat pjesëtohen me vlerën e absorbimit të standardit të parë (standardi zero) dhe shumëzohen me 100%.Kështu, standardi zero bëhet i barabartë me 100% dhe vlerat e absorbimit kuotohen në përqindje.
B
Absorbimi (%) = —— ×100%
B0
B ——standard (ose mostër) absorbimi
B0 —— standardi i përthithjes zero
10.2 Kurba standarde
----Për të vizatuar një kurbë standarde: Merrni vlerën e absorbimit të standardeve si bosht y, gjysmë logaritmike të përqendrimit të tretësirës standarde të tilozinës (ppb) si bosht x.
----Përqendrimi i tilosinës së çdo kampioni (ppb), i cili mund të lexohet nga kurba e kalibrimit, shumëzohet me faktorin përkatës të hollimit të çdo kampioni të ndjekur, dhe përftohet përqendrimi aktual i kampionit.
Ju lutemi vini re:
Për analizën e të dhënave është zhvilluar softuer special, i cili mund të sigurohet sipas kërkesës.
11. Ndjeshmëri, saktësi dhe saktësi
Ndjeshmëria e testit:1.5ppb
Kufiri i zbulimit:
Indet e kafshëve…………………………………………1.5 ppb Qumësht……………………………………………………..15 ppb Saktësia:
Indet e kafshëve………………………………………80±15%
Qumësht……………………………………………………80±10%
Saktësia:
Koeficienti i variacionit të kompletit ELISA është më pak se 10%.
12. Njoftim
12.1 Vlerat mesatare të vlerave të absorbimit të marra për standardet dhe mostrat do të reduktohen nëse reagentët dhe mostrat nuk janë rregulluar në temperaturën e dhomës (20-25℃).
12.2 Mos lejoni që mikropuset të thahen ndërmjet hapave për të shmangur riprodhueshmërinë e pasuksesshme dhe përdorni hapin tjetër menjëherë pasi trokitni lehtë mbi mbajtësin e mikropuseve.
12.3 Shkundni butësisht çdo reagent përpara përdorimit.
12.4 Mbajeni lëkurën tuaj larg solucionit ndalues sepse është 0.5 MH2SO4zgjidhje.
12.5 Mos i përdorni kompletet e vjetruara.Mos i ndërroni reagentët e grupeve të ndryshme, përndryshe do të ulë ndjeshmërinë.
12.6 Mbani kompletet ELISA në 2-8℃, mos ngrini.Mbyllni pllakat e mikrogropave të pushimit, Shmangni rrezet e diellit direkte gjatë të gjitha inkubacioneve.Rekomandohet mbulimi i pllakave të mikrotitrit.
12.7 Tretësira e nënshtresës duhet të braktiset nëse merr ngjyrë.Reagentët mund të prishen nëse vlera e absorbimit (450/630nm) e standardit zero është më e vogël se 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Reaksioni i ngjyrosjes ka nevojë për 15 minuta pas shtimit të tretësirës A dhe tretësirës B. Dhe ju mund të zgjasni intervalet e kohës së inkubacionit në 20 minuta ose më shumë nëse ngjyra është shumë e lehtë për t'u përcaktuar.Asnjëherë mos i kaloni 30 minuta, përkundrazi shkurtoni kohën e inkubacionit siç duhet.
12,9 Temperatura optimale e reagimit është 37℃.Temperatura më e lartë ose më e ulët do të çojë në ndryshime të vlerave të ndjeshmërisë dhe absorbimit.
13. Magazinimi
Gjendja e ruajtjes: 2-8℃.
Periudha e ruajtjes: 12 muaj.
