Tauvaga Enzyme Immunoassay Kit mo Su'esu'ega Fa'atele o Tylosin
Tauvaga Enzyme Immunoassay Kit mo
Su'esu'ega Fa'atatau oTylosin
1. Talaaga
Tylosino se vailaʻau faʻamaʻi macrolide, lea e masani ona faʻaaogaina e avea ma antibacterial ma anti-mycoplasma.Ua fa'atūina MRL ma'oti talu ai o lenei vaila'au e ono o'o atu ai i a'afiaga ogaoga i nisi vaega.
O lenei pusa o se oloa fou e faʻavae i luga o tekinolosi ELISA, e vave, faigofie, saʻo ma maaleale pe a faʻatusatusa i suʻesuʻega meafaigaluega masani ma e naʻo le 1.5 itula e manaʻomia i le tasi taʻaloga, e mafai ona faʻaitiitia ai le sese o le gaioiga ma le malosi o galuega.
2. Mataupu Faavae o le Su'ega
O lenei pusa e fa'avae i luga ole tekonolosi ELISA fa'atauva.O vaieli microtiter o loʻo ufiufi i le faʻapipiʻiina o antigen.Tylosin toega i le faʻataʻitaʻiga e tauva ma le antigen ua ufiufi i luga o le microtiter plate mo le antibody.A maeʻa le faʻaopoopoina o le enzyme faʻailoga anti-antibody, faʻaogaina le TMB substrate e faʻaalia ai le lanu.O le faʻaogaina o le faʻataʻitaʻiga e le lelei le fesoʻotaʻi ma le tylosin o loʻo nofo i totonu, pe a uma ona faʻatusatusa i le Standard Curve, faʻateleina i le mea faʻafefete, tylosin toega aofaʻi i le faʻataʻitaʻiga e mafai ona fuafua.
3. Talosaga
O lenei pusa e mafai ona faʻaaogaina i le quantitative ma qualitative analysis of tylosin tore i manu (moa, puaa, pato) ma le susu, meli, fuamoa, ma isi.
4. Fa'afeagai
Tylosin……………………………………………………..100%
Tilmicosin………………………………………………<2%
5. Mea e Manaomia
5.1 Meafaigaluega:
----Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)
---- Rotary evaporator po'o meafaifa'agogo nitrogen
----fa'atasi
----Sulu
----Centrifuge
----Paleni su'esu'e (inductance: 0.01g)
----Papa fa'au'u: 10ml
----Papa paipa matauila
----Volumetric fagu: 10ml
----Polystyrene centrifuge tubes: 50ml
----Micropipettes: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-telepine
5.2 Reagents:
----Sodium hydroxide (NaOH, AR)
----Sodium bicarbonate (NaHCO3,AR)
---- Sodium carbonate (NaCO3, AR)
----Trichloroacetic acid (AR)
---- Acetonitrile (AR)
----Ethyl acetate (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
----Suava fa'a'ona
6. Vaega Vaega
l Microtiter ipu ma 96 vaieli ufiufi i antigen
l fofo masani(5 fagu,1ml/fagu)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l fa'atonuga fa'apitoa: (1ml/fagu)1ppm
l Enzyme conjugate 1ml…………………..…pulou mumu
l vaifofo o le Antibody 7ml…………………………..pulou lanu meamata
l Fofo A 7ml……………………………………..pulou paepae
l Fofo B 7ml...……………………………..pulou mumu
l Taofi le vaifofo 7ml.…………………………………….pulou samasama
l 20×fa'ato'a fufulu vaifofo 40ml
…………………………………..…pulou manino
l 4 × faʻamaʻi faʻapipiʻi fofo 50ml
…………………………………………….pulou lanumoana
7. Sauniuniga Reagents:
Fofo 1:0.1mol/L NaOH fofo
Fua le 0.4g NaOH i le 100ml vai fa'afefeteina ma fa'afefiloi atoa.
Fofo 2: 1mol/L fofo NaOH
Fua le 4g NaOH i le 100ml vai fa'afefeteina ma fa'afefiloi atoa.
Fofo 3: Masima fa'amasima kaponi
Fofo1: 0.2M PB
Fa'amuta 51.6g o Na2HPO4·12H2O, 8.7g o le NaH2PO4·2H2O fa'atasi ai ma le vai fa'a'ona ma fa'afefe i le 1000ml.
Fofo2: Fofo o le aveeseina
Fa'asusu le vaifofo fa'aputu 2x fa'atasi ma le vai fa'asao ile fua fa'atatau ole 1:1(fa'ata'ita'iga 10ml o le 2xextraction solution + 10ml of deionized vai), lea o le a faʻaaogaina mo faʻataʻitaʻiga faʻataʻitaʻiga,e mafai ona teuina lenei fofo ile 4℃ mo le 1 masina.
Fofo3: Fufulu fofo
Fa'asusu le vaifofo fufulu 20x fa'atasi ma le vai fa'asao ile fua fa'atatau ole 1:19(fa'ata'ita'iga 5ml o le vaifofo fufulu 20x + 95ml vai fa'aonaona), lea o le a faʻaaogaina mo le fufuluina o papatusi.O lenei fofo e mafai ona teuina i le 4 ℃ mo le 1 masina.
8. Sauniuniga Faataitai
8.1 Faʻaaliga ma puipuiga aʻo leʻi faʻaaogaina:
(a) Fa'amolemole fa'aaoga fautuaga e tasi i le fa'agasologa o le fa'ata'ita'iga, ma sui fa'amatalaga pe a fa'asusu ese'esega.
(e) Ia mautinoa ua mama uma meafaigaluega.
(i) Taofi le fa'ata'ita'iga o mea'ai i le 'aisa.
(d) E tatau ona fa'aogaina fa'ata'ita'iga ua saunia mo su'ega i le taimi e tasi.
8.2 Aano o manu (moa, puaa, ma isi)
---- Faʻatasi le faʻataʻitaʻiga i le homogenizer;
---- Ave le 2.0±0.05g o le homogenate i totonu o le 50ml polystyrene centrifuge tube;faaopoopo le 2ml o le 0.2M PB (fofo1), lulu e solo, ona faaopoopo lea o le 8ml o le ethyl acetate ma lulu malosi mo le 3min;
---- Centrifuge mo le vavaeeseina: 3000g / ambient vevela / 5min.
---- Fa'aliliuina le 4ml o le vaega fa'alenatura sili i totonu o se fa'aigoa tioata 10ml, fa'amago i le vai ta'ele 50-60℃ i lalo o le vaitafe kasa nitrogen;
---- Fa'amuta le mea'ai mago ma le 1ml o le n-hexane, vortex mo le 30s e fa'amavae ai, ona fa'aopoopo lea o le 1ml o le vaifofo fa'ate'a (fofo2), vortex mo le 1 min.centrifuge mo le vavaeeseina: 3000g / ambient vevela / 5min
---- Aveese le vaega o le supernatant n-hexane;ave le 50μl o le substrate aqueous vaega mo suʻega.
Fa'aliga fa'afefe: 1
8.2 Suasusu
---- Ave le 100μl o le susu susu faʻataʻitaʻi, faʻafefiloi ma le 900μl o le faʻaaogaina o vaifofo (fofo2), ma faʻafefiloi atoa.
---- Ave le 50μl o le fofo saunia mo suʻega.
Fa'aliga fa'afefiloi: 10
9. Fa'agasologa o su'ega
9.1 Fa'aaliga a'o le'i faia le su'ega
9.1.1Ia mautinoa o lo'o tu'u uma i le vevela o le potu (20-25C).
9.1.2Toe fa'afo'i uma mea toe fa'afo'i i le 2-8℃ina ua uma ona faaaoga.
9.1.3Ole fufulu sa'o ole microwells ole la'asaga taua ile faiga ole su'ega;o le mea taua tele i le toe gaosia o le suʻesuʻega ELISA.
9.1.4 Afa'amama le moli ma ufiufi le microwells i le taimi e fa'agogo ai.
9.2 Laasaga Su'esu'e
9.2.1 Ave uma mea fa'afofoga i fafo ile vevela ole potu (20-25℃) mo le sili atu ile 30min, lulu lemu a'o le'i fa'aoga.
9.2.2 Aumai i fafo microwells o lo'o mana'omia ma toe fa'afo'i le vaega o totoe i totonu o le taga sipi-loka ile 2-8℃ vave.
9.2.3 O le vaifofo fufulu vai e tatau ona toe fa'amafanafana i le vevela o le potu a'o le'i fa'aogaina.
9.2.4Numera:Faanumera uma tulaga microwell ma tulaga uma ma faataitaiga e tatau ona fa'alua.Faamaumau tulaga ma tulaga faataitai.
9.2.5Add fofo masani/fa'ata'ita'iga ma vaifofo fa'ama'i: Faaopopo le 50µl o vaifofo masani((pusa ua saunia)) po'o le fa'ata'ita'iga saunia i vaieli talafeagai.Faaopopo le 50µl o le vaifofo antibody(pusa ua saunia).Faafefiloi lemu e ala i le luluina o le ipu ma le lima ma faʻagogo mo le 30 minute i le 37 ℃ ma le ufiufi.
9.2.6Fufulu: Aveese lemu le ufiufi ma fa'amama le vai mai vaieli ma fufulu microwells ile 250µl vaifofo fufulu (fofo3) i le va o le 10s mo le 4-5 taimi.Fa'asusu le vai o lo'o totoe i se pepa fa'afefe (o le vaega o totoe o le ea e mafai ona fa'aumatia i le pito e le'o fa'aaogaina).
9.2.7Faaopopo le enzyme conjugate: Fa'aopoopo le 100ml ole vaifofo conjugate enzyme(pusa ua saunia) i vaieli ta'itasi, fa'afefiloi malie ma fa'asusu mo le 30min i le 37 ℃ fa'atasi ma le ufiufi.Toe fai le la'asaga fufulu.
9.2.8Valivali: Fa'aopoopo le 50µl ole vaifofo A(pusa ua saunia) ma le 50µl o vaifofo B(pusa ua saunia) i vaieli taitasi.Fa'afefiloi malie ma fa'a'a'u mo le 15min i le 37 ℃ fa'atasi ma le ufiufi.
9.2.9Fua: Fa'aopoopo le 50µl ole vaifofo taofi(pusa ua saunia) i vaieli taitasi.Faafefiloi malie ma fua le mitiia i le 450nm (E fautuaina le fuaina i le lua-galu umi o le 450/630nm. Faitau le taunuuga i totonu o le 5min pe a uma ona faaopoopo le fofo taofi).
10. I'uga
10.1 pasene o le mitiia
O tau faʻatatau o le faʻaogaina o mea e maua mo faʻataʻitaʻiga ma faʻataʻitaʻiga e vaevaeina i le tau faʻafefe o le tulaga muamua (zero standard) ma faʻateleina i le 100%.Ole tulaga ole zero ua fa'apea ua tutusa ile 100% ma o tau o le absorbance o lo'o ta'ua i pasene.
B
Fa'asa'o (%) = —— ×100%
B0
B ——absorbance standard (poʻo faʻataʻitaʻiga)
B0 ——absorbance zero standard
10.2 Pi'o masani
----Ia tusi se pi'o masani: Ave le tau o le mitiia o tulaga e pei o le y-axis, semi logarithmic o le fa'aogaina o le vaifofo tulaga faataatitia tylosin (ppb) e pei o le x-axis.
----O le tui o le tylosin o faʻataʻitaʻiga taʻitasi (ppb), lea e mafai ona faitau mai le faʻasologa o le faʻavasegaina, e faʻateleina i le faʻaogaina o le Dilution faʻatatau o faʻataʻitaʻiga taʻitasi mulimulitaʻi, ma maua ai le faʻatonuga moni o faʻataʻitaʻiga.
Faamolemole matau:
polokalama faʻapitoa ua atiaʻe mo suʻesuʻega faʻamaumauga, lea e mafai ona tuʻuina atu i luga ole talosaga.
11. Ma'ale'ale, sa'o ma sa'o
Su'ega ma'ale'ale:1.5ppb
Fa'atapula'a su'esu'ega:
Igoa o manu……………………………………………………1.5ppb Susu………………………………………………………………15ppb Sa'o:
Aano o manu ……………………………………………80±15%
Suasusu …………………………………………… 80±10%
Sa'o:
Ole fa'asologa ole suiga ole pusa ELISA e itiiti ifo ile 10%.
12. Matauina
12.1 Ole a fa'aitiitia le fa'atatauga ole su'esu'ega e maua mo fa'ata'ita'iga ma fa'ata'ita'iga pe afai e le'i fa'atulafonoina mea fa'afofo ma fa'ata'ita'iga ile vevela potu (20-25℃).
12.2 Aua le faatagaina microwells e mago i le va o laasaga e aloese ai mai le le manuia o le toe gaosia ma faagaoioia le isi laasaga i le taimi lava e uma ai le tataina o le microwells holders.
12.3 Lulu lemu ia mea fa'afefiloi a'o le'i fa'aogaina.
12.4 Taofi lou pa'u mai le vaifofo taofi aua e 0.5MH2SO4fofo.
12.5 Aua le fa'aogaina pusa ua tuai.Aua nei fesuia'i le reagents o vaega eseese, a leai o le a pa'u ai le maaleale.
12.6 Taofi pusa ELISA ile 2-8℃, aua le fa'aisa.Faamaufa'ailoga ipu microwell malolo, 'Alo'ese sa'o le susulu o le la i le taimi o fa'afuga uma.E fautuaina le ufiufi o ipu microtiter.
12.7 E tatau ona lafoa'i le vaifofo o le eleele pe a liu lanu.E mafai ona leaga le reagents pe afai o le absorbance value (450/630nm) o le zero standard e itiiti ifo i le 0.5 (A450nm<0.5).
12.8 O le tali lanu e manaʻomia le 15min pe a maeʻa le faʻaopoopoga o le fofo A ma le fofo B. Ma e mafai ona e faʻaumiumi le taimi o le incubation i le 20min pe sili atu pe afai o le lanu e malamalama tele e fuafua.Aua nei sili atu i le 30min, i se isi itu, faʻapuʻupuʻu le taimi faʻamaʻi lelei.
12.9 O le vevela tali sili ona lelei e 37 ℃.O le maualuga pe maualalo le vevela o le a taʻitaʻia ai suiga o le maaleale ma le faʻaogaina o tau.
13. Teuina
Tulaga teuina: 2-8℃.
Taimi e teu ai: 12 masina.
