ထုတ်ကုန်

1. နောက်ခံ

Tylosinပိုးသတ်ဆေးနှင့် mycoplasma ဆန့်ကျင်ဘက်တီးရီးယားများအဖြစ် အဓိကအားဖြင့် အသုံးပြုသည့် macrolide ပဋိဇီဝဆေးဖြစ်သည်။ဤဆေးသည် အချို့သောအုပ်စုများတွင် ပြင်းထန်သောဘေးထွက်ဆိုးကျိုးဖြစ်စေနိုင်သောကြောင့် တင်းကျပ်သော MRLs များကို တည်ထောင်ထားသည်။

ဤကိရိယာသည် ELISA နည်းပညာကို အခြေခံထားသည့် ထုတ်ကုန်အသစ်ဖြစ်ပြီး၊ သာမန်ကိရိယာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက မြန်ဆန်၊ လွယ်ကူ၊ တိကျပြီး အကဲဆတ်နိုင်ပြီး လုပ်ဆောင်ချက်တစ်ခုတွင် 1.5 နာရီသာ လိုအပ်သောကြောင့် လည်ပတ်မှုအမှားအယွင်းနှင့် အလုပ်ပြင်းထန်မှုကို သိသိသာသာ လျှော့ချနိုင်သည်။

2. စမ်းသပ်မှုအခြေခံ

ဤကိရိယာသည် သွယ်ဝိုက်ယှဉ်ပြိုင်နိုင်သော ELISA နည်းပညာကို အခြေခံထားသည်။microtiter ရေတွင်းများကို coupling antigen ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသည်။နမူနာရှိ Tylosin အကြွင်းအကျန်သည် ပဋိပစ္စည်းအတွက် မိုက်ခရိုတီတာပြားပေါ်ရှိ အန်တီဂျင်နှင့် ယှဉ်ပြိုင်သည်။Anti-antibody တံဆိပ်တပ်ထားသော အင်ဇိုင်းကို ပေါင်းထည့်ပြီးနောက်၊ အရောင်ကိုပြသရန် TMB အလွှာကို အသုံးပြုသည်။နမူနာ၏ စုပ်ယူမှုသည် ၎င်းတွင်ရှိသော tylosin နှင့် အနုတ်လက္ခဏာဆောင်သော ဆက်စပ်နေပါသည်။ Standard Curve နှင့် နှိုင်းယှဉ်ကာ၊ ဖျော့ဖျော့ဖျော့အားဖြင့် မြှောက်ပါက၊ နမူနာရှိ tylosin အကြွင်းအကျန်ပမာဏကို တွက်ချက်နိုင်ပါသည်။

3. အသုံးချမှုများ

ဤကိရိယာကို တိရစ္ဆာန်တစ်သျှူးများ (ကြက်၊ ဝက်၊ ဘဲ) နှင့် နို့၊ ပျားရည်၊ ဥစသည်တို့တွင် tylosin အကြွင်းအကျန်များကို အရေအတွက်နှင့် အရည်အသွေးပိုင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရာတွင် အသုံးပြုနိုင်သည်။

4. အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများ

Tylosin …………………………………………………….. 100%

Tilmicosin ………………………………………………<2%

5. လိုအပ်သောပစ္စည်းများ

5.1 စက်ပစ္စည်းများ-

---- Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)

---- Rotary evaporator သို့မဟုတ် နိုက်ထရိုဂျင် အခြောက်ခံကိရိယာများ

---- တစ်သားတည်းဖြစ်စေခြင်း။

---- Shaker

---- အာရုံစူးစိုက်မှု

---- ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာလက်ကျန် (inductance: 0.01g)

---- Graduated pipette: 10ml

---- ရော်ဘာပိုက်လုံး မီးသီး

---- Volumetric ဓာတ်ဘူး: 10ml

----Polystyrene centrifuge tubes: 50ml

----Micropipettes: 20-200ml၊ 100-1000ml

250ml- မျိုးစုံ

5.2 ဓာတ်ပစ္စည်းများ-

----ဆိုဒီယမ်ဟိုက်ဒရောဆိုဒ် (NaOH၊ AR)

---- ဆိုဒီယမ် ဘိုင်ကာဗွန်နိတ် (NaHCO_3,AR)

---- ဆိုဒီယမ်ကာဗွန်နိတ် (NaCO₃AR)

---- Trichloroacetic acid (AR)

---- Acetonitrile (AR)

---- Ethyl acetate (AR)

┅┅n-Hexane (AR)

---- Deionized ရေ

6. Kit အစိတ်အပိုင်းများ

l အန်တီဂျင်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသော ရေတွင်း 96 တွင်းပါရှိသော Microtiter ပန်းကန်

l စံဖြေရှင်းချက် (၅ ပုလင်း၊ ၁ မီလီလီတာ/ပုလင်း)

0ppb၊ 0.5ppb၊ 1.5ppb၊ 4.5ppb၊ 13.5ppb

l Spiking standard control- (1ml/ပုလင်း)1ppm

l Enzyme conjugate 1ml ………………………..… အနီရောင်ထုပ်

l Antibody solution 7ml ………………….အစိမ်းထုပ်

l ဖြေရှင်းချက် A 7ml ……………………….……… အဖြူထုပ်

l Solution B 7ml …………………………………….. အနီထုပ်

l Stop solution 7ml.……………………….အဝါရောင်ထုပ်

l 20× စုစည်းထားသော လက်ဆေးရည် 40ml

……………………………………….. ပွင့်လင်းထုပ်

l 4× စုစည်းထားသော ထုတ်ယူမှုဖြေရှင်းချက် 50ml

……………………………………………….အပြာရောင်ဦးထုပ်

7. ဓါတ်ကူပစ္စည်းပြင်ဆင်မှု-

ဖြေရှင်းချက် 1-0.1mol/L NaOH ဖြေရှင်းချက်

0.4g NaOH ကို အလေးချိန် 100ml မှ deionized water နှင့် လုံးဝရောမွှေပါ။

ဖြေရှင်းချက် ၂: 1mol/L NaOH ဖြေရှင်းချက်

4g NaOH ကို အလေးချိန် 100ml မှ deionized water နှင့် လုံးဝရောမွှေပါ။

ဖြေရှင်းချက် ၃: ကာဗွန်နိတ်ကြားခံဆား

ဖြေရှင်းချက်1: 0.2M PB

Na ၏ 51.6g ကို အရည်ဖျော်ပါ။₂HPO₄· 12 နာရီ₂O၊ NaH 8.7 ဂရမ်₂PO₄· 2 နာရီ₂O ကို deionized water ဖြင့် 1000ml သို့ ရောမွှေပါ။

ဖြေရှင်းချက်2: ထုတ်ယူမှုဖြေရှင်းချက်

ထုထည် အချိုးအစား 1:1 တွင် 2× စုစည်းထားသော ထုတ်ယူရည်ကို ဒိုင်းယွန်နစ်ရေဖြင့် အအေးခံပါ။ဥပမာ- 10ml 2×extraction solution + deionized water 10ml) နမူနာထုတ်ယူရာတွင် အသုံးပြုမည့်၊ဤဖြေရှင်းချက်ကို 4 ℃ 1 လကြာသိမ်းဆည်းထားနိုင်သည်။.

ဖြေရှင်းချက်3: ရေဆေးပါ။

ထုထည်အချိုးအစား 1:19 တွင် 20× ကွန်မြူနတီဆေးရည်ကို ဒိုင်းယွန်နစ်ရေဖြင့် ရောမွှေပါ။ဥပမာ- 5ml 20×wash solution + deionized water 95ml) ပန်းကန်ဆေးရာတွင် အသုံးပြုမည့်။ဤဖြေရှင်းချက်ကို 4 ℃ တွင် 1 လကြာသိမ်းဆည်းထားနိုင်သည်။.

8. နမူနာပြင်ဆင်မှုများ

8.1 မလည်ပတ်မီ သတိပေးချက်နှင့် ကြိုတင်ကာကွယ်မှုများ-

(က) စမ်းသပ်မှု လုပ်ငန်းစဉ်တွင် တစ်ကြိမ်တည်း အကြံပြုချက်များကို အသုံးပြုကာ မတူညီသော ဓာတ်ပစ္စည်းများကို စုပ်ယူသည့်အခါ အကြံပြုချက်များကို ပြောင်းလဲပါ။

(ခ) တူရိယာအားလုံး သန့်ရှင်းကြောင်း သေချာပါစေ။

(ဂ) တစ်ရှူးနမူနာကို အေးခဲထားပါ။

(ဃ) စစ်ဆေးမှုအတွက် ပြင်ဆင်ထားသည့်နမူနာကို တစ်ပြိုင်နက် အသုံးပြုသင့်သည်။

8.2 တိရစ္ဆာန်တစ်သျှူး (ကြက်၊ ဝက်၊ စသည်)၊

---- နမူနာကို homogenizer ဖြင့် တစ်သားတည်းဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ပါ။

---- 2.0±0.05g ကို 50ml polystyrene centrifuge tube ထဲသို့ တစ်သားတည်းဖြစ်အောင် ယူပြီး၊2ml 0.2M PB (ဖြေရှင်းချက်1) အရည်ဖျော်ပြီး ethyl acetate 8ml ထည့်ပြီး 3 မိနစ်ခန့် ပြင်းပြင်းထန်ထန် လှုပ်ခါပါ။

----ခွဲထုတ်ခြင်းအတွက် အာရုံခံကိရိယာ- 3000g / ပတ်ဝန်းကျင်အပူချိန် / 5min ။

---- နိုက်ထရိုဂျင်ဓာတ်ငွေ့စီးကြောင်းအောက်တွင် 50-60 ℃ ရေချိုးခြင်းဖြင့် ခြောက်သွေ့သော 10ml ဖန်ပြွန်ထဲသို့ 4ml ကို supernatant အော်ဂဲနစ်အဆင့်သို့ လွှဲပြောင်းပါ။

----အခြောက်အကြွင်းအကျန်များကို n-hexane 1ml ဖြင့် အရည်ဖျော်ပြီး 30 နှစ်ကြာ ရေပျော်စေပြီးနောက် ထုတ်ယူသည့်အရည် 1ml ထည့်ပါ။ဖြေရှင်းချက်2) 1min များအတွက် vortex ။ခွဲထုတ်ရန်အတွက် centrifuge: 3000g / ပတ်ဝန်းကျင်အပူချိန် / 5min

---- supernatant n-hexane အဆင့်ကို ဖယ်ရှားပါ။စစ်ဆေးမှုအတွက် ဆပ်စထရိတ်ရေသည် အဆင့်၏ 50μl ကိုယူပါ။

Dilution factor: ၁

8.2 နို့

---- နို့စိမ်းနမူနာ 100μl ကိုယူပြီး 900μl ထုတ်ယူမှုဖြေရှင်းချက် (ဖြေရှင်းချက်2) လုံးဝရောမွှေပါ။

---- စစ်ဆေးမှုအတွက် ပြင်ဆင်ထားသော အဖြေ၏ 50μl ကိုယူပါ။

Dilution factor: 10

9. ဆန်းစစ်မှုလုပ်ငန်းစဉ်

9.1 မစစ်ဆေးမီသတိပေးချက်

၉.၁.၁ဓာတ်ကူပစ္စည်းနှင့် မိုက်ခရိုဝဲလ်များအားလုံးကို အခန်းအပူချိန် (20-25 ℃) တွင် သေချာပါစေ။

၉.၁.၂ကျန်တဲ့ ဓါတ်ပေါင်း ၂-၈ ကို ပြန်ပေးပါ။℃အသုံးပြုပြီးပြီးချင်း။

၉.၁.၃မိုက်ခရိုဝဲလ်များကို မှန်ကန်စွာဆေးကြောခြင်းသည် စစ်ဆေးမှုလုပ်ငန်းစဉ်တွင် အရေးကြီးသောအဆင့်တစ်ခုဖြစ်သည်။၎င်းသည် ELISA ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ မျိုးပွားနိုင်စွမ်းအတွက် အရေးကြီးသောအချက်ဖြစ်သည်။

9.1.4 Aအလင်းရောင်ကို ဖယ်ထားပြီး ပေါက်ဖွားစဉ်အတွင်း microwells များကို ဖုံးအုပ်ထားပါ။

9.2 စစ်ဆေးမှုအဆင့်များ

9.2.1 မိနစ် 30 ကျော်ကြာ အခန်းအပူချိန် (20-25 ℃) တွင် ဓာတ်ပစ္စည်းများအားလုံးကို ထုတ်ပြီး အသုံးမပြုမီ ညင်သာစွာ လှုပ်ယမ်းပါ။

9.2.2 လိုအပ်သော မိုက်ခရိုဝဲလ်များကိုထုတ်ယူပြီး ကျန်ကြွင်းသောအရာများကို ဇစ်သော့အိတ်ထဲသို့ 2-8 ℃ ချက်ခြင်းပြန်ပေးပါ။

9.2.3 အသုံးမပြုမီ အခန်းအပူချိန်တွင် အရောအနှောရှိသော လက်ဆေးရည်ကို ပြန်လည်နွေးသင့်သည်။

၉.၂.၄နံပါတ်-microwell ရာထူးတိုင်းကို ရေတွက်ပြီး စံနှုန်းများနှင့် နမူနာများအားလုံးကို ပွားနေရပါမည်။စံချိန်စံညွှန်းများနှင့် နမူနာရာထူးများကို မှတ်တမ်းတင်ပါ။

၉.၂.၅Add စံဖြေရှင်းချက်/နမူနာနှင့် ပဋိပစ္စည်းဖြေရှင်းချက်စံဖြေရှင်းချက် 50µl ကိုထည့်ပါ((အစုံပေးထားသည်။)) သို့မဟုတ် သက်ဆိုင်ရာရေတွင်းများသို့ နမူနာပြင်ဆင်ပါ။ပဋိပစ္စည်းဖြေရှင်းချက် 50µl ထည့်ပါ (အစုံပေးထားသည်။)ပန်းကန်ပြားကို လက်ဖြင့်လှုပ်ခြင်းဖြင့် ညင်သာစွာရောမွှေပြီး အဖုံးဖြင့် ၃၇ ဒီဂရီ စင်တီဂရိတ်တွင် မိနစ် 30 ကြာ မီးဖုတ်ပါ။

၉.၂.၆ရေဆေးပါ။: အဖုံးကို ညင်သာစွာဖယ်ရှားပြီး ရေတွင်းထဲကအရည်တွေကို သန့်စင်ပြီး 250µl ဖျော်ရည်ဖြင့် မိုက်ခရိုဝဲလ်များကို ဆေးကြောပါ (ဖြေရှင်းချက်3) 10s ၏ကြားတွင် 4-5 ကြိမ်။ကျန်ရှိသောရေကို စုပ်စက္ကူဖြင့် စုပ်ယူပါ (ကျန်သောလေပူဖောင်းများကို အသုံးမပြုသော ထိပ်ဖျားဖြင့် ဖယ်ရှားနိုင်သည်)။

၉.၂.၇အင်ဇိုင်း conjugate ထည့်ပါ။: အင်ဇိုင်းပေါင်း 100ml ပေါင်းထည့်ပါ(အစုံပေးထားသည်။) ရေတွင်းတစ်ခုစီကို ညင်သာစွာရောမွှေပြီး အဖုံးအုပ်ပြီး 37 ℃ မှာ မိနစ် 30 နှပ်ထားပါ။ရေဆေးတဲ့အဆင့်ကို နောက်တစ်ကြိမ်ထပ်လုပ်ပါ။.

၉.၂.၈အရောင်ခြယ်ခြင်း။ဖြေရှင်းချက် A(50µl) ထည့်ပါ။အစုံပေးထားသည်။) နှင့် ဖြေရှင်းချက် 50µl B(အစုံပေးထားသည်။) ရေတွင်းတစ်ခုစီသို့။ညင်သာစွာရောမွှေပြီး ၃၇ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၁၅ မိနစ်ခန့် အဖုံးအုပ်ထားပါ။

၉.၂.၉တိုင်းတာသည်။ရပ်တန့်ဖြေရှင်းချက်၏ 50µl ကိုထည့်ပါ(အစုံပေးထားသည်။) ရေတွင်းတစ်ခုစီသို့။ညင်သာစွာရောစပ်ပြီး စုပ်ယူမှုကို 450nm ဖြင့် တိုင်းတာပါ (၎င်းသည် 450/630nm လှိုင်းအလျားနှစ်ခုဖြင့် အကြံပြုထားသည်။ ရပ်တန့်ဖြေရှင်းချက်ထည့်ပြီးနောက် 5 မိနစ်အတွင်း ရလဒ်ကိုဖတ်ပါ)။

10. ရလဒ်များ

စုပ်ယူမှု 10.1 ရာခိုင်နှုန်း

စံချိန်စံညွှန်းများအတွက်ရရှိသော စုပ်ယူမှုတန်ဖိုးများ၏ ပျမ်းမျှတန်ဖိုးများနှင့် နမူနာများကို ပထမစံနှုန်း (သုညစံ) ၏ စုပ်ယူမှုတန်ဖိုးဖြင့် ပိုင်းခြားပြီး 100% ဖြင့် မြှောက်ထားသည်။ထို့ကြောင့် သုညစံနှုန်းကို 100% နှင့် ညီစေပြီး စုပ်ယူမှုတန်ဖိုးများကို ရာခိုင်နှုန်းများဖြင့် ကိုးကားထားသည်။

B

စုပ်ယူမှု (%) = —— × 100%

B0

B —စုပ်ယူမှုစံနှုန်း (သို့မဟုတ်နမူနာ)

B0 — စုပ်ယူမှု သုညစံ

10.2 Standard Curve

---- စံမျဉ်းကွေးတစ်ခုဆွဲရန်- y-ဝင်ရိုးအဖြစ် စံနှုန်းများ၏ စုပ်ယူမှုတန်ဖိုး၊ tylosin စံနှုန်းဖြေရှင်းချက် (ppb) ၏ အာရုံစူးစိုက်မှု၏ တစ်ပိုင်းလော့ဂရစ်သမ်ကို x-ဝင်ရိုးအဖြစ် ယူပါ။

---- နမူနာတစ်ခုစီ၏ tylosin အာရုံစူးစိုက်မှု (ppb) ကို ချိန်ညှိမျဉ်းကွေးမှ ဖတ်နိုင်သည့် တိုင်လိုဆင် အာရုံစူးစိုက်မှုကို လိုက်နာခြင်းဖြင့် နမူနာတစ်ခုစီ၏ သက်ဆိုင်ရာ Dilution factor ဖြင့် မြှောက်ပြီး နမူနာ၏ အမှန်တကယ် စူးစိုက်မှုကို ရရှိသည်။

သတိပြုပါ-

တောင်းဆိုမှုအရ ပံ့ပိုးပေးနိုင်သည့် ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် အထူးဆော့ဖ်ဝဲကို တီထွင်ထားပါသည်။

11. အာရုံခံနိုင်စွမ်း၊ တိကျမှုနှင့် တိကျမှု

စမ်းသပ်မှု အာရုံခံနိုင်စွမ်း-1.5ppb

ထောက်လှမ်းကန့်သတ်ချက်-

တိရစ္ဆာန်တစ်သျှူး …………………………………………………… ၁.၅ ppb နို့…………………………………………………………..15ppb တိကျမှု-

တိရစ္ဆာန်တစ်သျှူး ……………………………………………… 80±15%

နို့………………………………………..……….……80±10%

တိကျမှု-

ELISA အစုံ၏ ပြောင်းလဲခြင်းကိန်းဂဏန်းသည် 10% ထက်နည်းသည်။

12. သတိထားပါ။

12.1 စံချိန်စံညွှန်းများအတွက် ရရှိသော စုပ်ယူမှုတန်ဖိုးများနှင့် နမူနာများကို အခန်းအပူချိန် (20-25 ℃) တွင် ဓါတ်ပြုခြင်းနှင့် နမူနာများကို ထိန်းညှိခြင်းမပြုပါက ပျမ်းမျှတန်ဖိုးများ လျော့ကျသွားမည်ဖြစ်သည်။

12.2 မအောင်မြင်သော မျိုးပွားမှုကို ရှောင်ရှားရန်နှင့် microwells ကိုင်ဆောင်ထားသူကို နှိပ်ပြီးနောက် နောက်တဆင့်ကို ချက်ချင်းလုပ်ဆောင်ရန် မိုက်ခရိုဝဲလ်များကို အဆင့်များကြားတွင် ခြောက်အောင် ခွင့်မပြုပါနှင့်။

12.3 အသုံးမပြုမီ ဓါတ်ပစ္စည်းတစ်ခုစီကို ညင်သာစွာလှုပ်ယမ်းပါ။

12.4 ၎င်းသည် 0.5MH ဖြစ်သောကြောင့် သင့်အရေပြားကို ရပ်တန့်ထားသော အဖြေနှင့် ဝေးဝေးထားပါ။₂SO₄ဖြေရှင်းချက်။

12.5 ကိရိယာအစုံအလင်ကို ခေတ်မမီပါနှင့်။မတူညီသောအသုတ်များ၏ ဓာတ်ပစ္စည်းများကို မလဲလှယ်ပါနှင့်၊ သို့မဟုတ်ပါက sensitivity ကျဆင်းသွားမည်ဖြစ်သည်။

12.6 ELISA အစုံအလင်ကို 2-8 ℃ တွင် အေးခဲမနေပါနှင့်။အလုံပိတ် မိုက်ခရိုဝဲလ်ပြားများကို အလုံပိတ်၊ ပေါက်ဖွားစဉ်အတွင်း နေရောင်ခြည် တည့်တည့်ကို ရှောင်ပါ။မိုက်ခရိုတီတာပြားများကို ဖုံးအုပ်ရန် အကြံပြုထားသည်။

12.7 အရောင်ပြောင်းပါက ဆပ်ပြာရည်ကို စွန့်ပစ်သင့်သည်။သုညစံနှုန်း၏ စုပ်ယူမှုတန်ဖိုး (450/630nm) သည် 0.5 (A450nm<0.5) ထက်နည်းပါက ဓာတ်ပစ္စည်းများသည် ဆိုးရွားသွားနိုင်သည်။

12.8 ရောင်ခြယ်တုံ့ပြန်မှုသည် အဖြေ A နှင့် အဖြေ B တို့ကို ပေါင်းထည့်ပြီးနောက် 15 မိနစ် လိုအပ်သည်။ ထို့နောက် အရောင်ဖျော့လွန်းပါက ပေါက်ဖွားချိန်ကို မိနစ် 20 သို့မဟုတ် ထို့ထက်ပို၍ ရှည်စေနိုင်သည်။30 မိနစ်ထက်မပိုစေဘဲ၊ ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနှင့် ပေါက်ဖွားချိန်ကို မှန်ကန်စွာ တိုစေပါ။

12.9 အကောင်းဆုံးတုံ့ပြန်မှုအပူချိန်မှာ 37 ℃ ဖြစ်သည်။မြင့်မားသော သို့မဟုတ် နိမ့်သော အပူချိန်သည် အာရုံခံနိုင်စွမ်းနှင့် စုပ်ယူမှုတန်ဖိုးများ အပြောင်းအလဲများဆီသို့ ဦးတည်သွားမည်ဖြစ်သည်။

13. သိုလှောင်မှု

သိုလှောင်မှုအခြေအနေ: 2-8 ℃။

သိုလှောင်မှုကာလ: 12 လ.