Kit ta' Immunoassay ta' Enżimi Kompetittivi għal Analiżi Kwantitattiva ta' Tylosin
Kit ta' Immunoassay ta' Enżimi Kompetittivi għal
Analiżi kwantitattiva ta'Tylosin
1. Sfond
Tylosinhuwa antibijotiku makrolidu, li huwa prinċipalment applikat bħala antibatteriċi u anti-mycoplasma.Ġew stabbiliti MRLs stretti peress li din il-mediċina tista 'twassal għal effett sekondarju serju f'ċerti gruppi.
Dan il-kit huwa prodott ġdid ibbażat fuq teknoloġija ELISA, li hija veloċi, faċli, preċiża u sensittiva meta mqabbla ma 'analiżi strumentali komuni u teħtieġ biss 1.5 sigħat f'operazzjoni waħda, tista' tnaqqas b'mod konsiderevoli l-iżball ta 'tħaddim u l-intensità tax-xogħol.
2. Prinċipju tat-Test
Dan il-kit huwa bbażat fuq teknoloġija ELISA kompetittiva indiretta.Il-bjar tal-mikrotiter huma miksija bl-antiġen tal-igganċjar.Residwu tat-tylosin fil-kampjun jikkompeti mal-antiġen miksi fuq il-pjanċa tal-mikrotiter għall-antikorp.Wara ż-żieda ta 'anti-antikorp immarkat b'enzima, is-sottostrat TMB jintuża biex juri l-kulur.L-assorbiment tal-kampjun huwa relatat b'mod negattiv mat-tilosin li jirrisjedi fih, wara li jitqabbel mal-Kurva Standard, immultiplikat bil-fattur ta 'dilwizzjoni, il-kwantità ta' residwu ta 'tylosin fil-kampjun tista' tiġi kkalkulata.
3. Applikazzjonijiet
Dan il-kit jista 'jintuża f'analiżi kwantitattiva u kwalitattiva ta' residwu ta 'tylosin fit-tessut tal-annimali (tiġieġ, majjal, papra) u ħalib, għasel, bajd, eċċ.
4. Reazzjonijiet inkroċjati
Tylosin…………………………………………………… ..100%
Tilmicosin……………………………………………………<2%
5. Materjali Meħtieġa
5.1 Tagħmir:
---- Spettrofotometru tal-pjanċa tal-mikrotiter (450nm/630nm)
---- Evaporatur li jdur jew strumenti tat-tnixxif tan-nitroġenu
----omoġenizzatur
----Shaker
---- Ċentrifuga
---- Bilanċ analitiku (inductance: 0.01g)
---- Pipetta gradwata: 10ml
---- Bozza tal-pipetta tal-gomma
----Flask volumetriku: 10ml
----Tubi ċentrifugi tal-polistirene: 50ml
---- Mikropipetti: 20-200ml, 100-1000ml
250ml-multipipette
5.2 Reaġenti:
----Idrossidu tas-sodju (NaOH, AR)
---- Bikarbonat tas-sodju (NaHCO3,AR)
---- Karbonat tas-sodju (NaCO3, AR)
---- Aċidu trikloroaċetiku (AR)
---- Aċetonitrile (AR)
----Etil aċetat (AR)
┅┅n-Hexane (AR)
----Ilma dejonizzat
6. Kit Komponenti
l Pjanċa tal-mikrotiter b'96 ħofra miksija bl-antiġen
l Soluzzjonijiet standard (5 fliexken, 1ml/flixkun)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Kontroll standard ta 'spiking: (1ml/flixkun)1ppm
l Enżima konjugata 1ml……………..…..…tapp aħmar
l Soluzzjoni ta' antikorp 7ml……………….……tapp aħdar
l Soluzzjoni A 7ml………….….……tapp abjad
l Soluzzjoni B 7ml……………………………..tapp aħmar
l Stop solution 7ml.…………….……….tapp isfar
l 20 × soluzzjoni tal-ħasil konċentrata 40ml
…………………………………………..…tapp trasparenti
l 4 × soluzzjoni ta 'estrazzjoni kkonċentrata 50ml
……………………………………………………….tapp blu
7. Preparazzjoni tar-reaġenti:
Soluzzjoni 1:Soluzzjoni NaOH 0.1mol/L
Iżen 0.4g NaOH sa 100ml ilma dejonizzat u ħawwad kompletament.
Soluzzjoni 2: 1mol/L soluzzjoni NaOH
Iżen 4g NaOH sa 100ml ilma dejonizzat u ħawwad kompletament.
Soluzzjoni 3: Melħ buffer tal-karbonat
Soluzzjoni1: 0.2M PB
Dewweb 51.6g ta 'Na2HPO4·12H2O, 8.7g ta 'NaH2PO4·2H2O b'ilma dejonizzat u ħallat għal 1000ml.
Soluzzjoni2: Soluzzjoni ta 'estrazzjoni
Iddilwa s-soluzzjoni ta' estrazzjoni 2×konċentrata b'ilma dejonizzat fil-proporzjon tal-volum ta' 1:1(eż. 10ml ta' 2×soluzzjoni ta' estrazzjoni + 10ml ta' ilma dejonizzat), li se jintużaw għall-estrazzjoni tal-kampjun,din is-soluzzjoni tista 'tinħażen f'4℃ għal xahar.
Soluzzjoni3: Aħsel soluzzjoni
Iddilwa s-soluzzjoni tal-ħasil 20 × konċentrata b'ilma dejonizzat fil-proporzjon tal-volum ta '1:19(eż. 5ml ta' 20×soluzzjoni tal-ħasil + 95ml ta' ilma dejonizzat), li se jintużaw għall-ħasil tal-pjanċi.Din is-soluzzjoni tista 'tinħażen f'4℃ għal xahar.
8. Preparazzjonijiet tal-Kampjuni
8.1 Avviż u prekawzjonijiet qabel l-operazzjoni:
(a) Jekk jogħġbok uża ponot ta 'darba fil-proċess tal-esperiment, u ibdel il-ponot meta jassorbi reaġent differenti.
(b) Kun żgur li l-istrumenti kollha huma nodfa.
(c) Żomm il-kampjun tat-tessut fil-friża.
(d) Kampjun ippreparat għandu jintuża għall-assaġġ f'daqqa.
8.2 Tessut tal-annimali (tiġieġ, majjal, eċċ)
----Omoġenizza l-kampjun b'omoġenizzatur;
---- Ħu 2.0±0.05g ta 'omoġenat f'tubu ċentrifugu tal-polistirene ta' 50ml;żid 2ml ta' 0.2M PB (soluzzjoni1), ħawwad biex jinħall, u mbagħad żid 8ml ta 'aċetat etiliku u ħawwad bil-biża għal 3min;
---- Ċentrifuga għas-separazzjoni: 3000g / temperatura ambjentali / 5min.
---- Ittrasferixxi 4ml tal-fażi organika supernatant f'tubu tal-ħġieġ ta '10ml, nixxef b'banju ta' l-ilma ta '50-60℃ taħt nixxiegħa tal-gass tan-nitroġenu;
---- Dewweb il-fdal niexef b'1ml ta 'n-hexane, vortex għal 30s biex jinħall, u mbagħad żid 1ml ta' soluzzjoni ta 'estrazzjoni (soluzzjoni2), vortex għal 1min.ċentrifuga għas-separazzjoni: 3000g / temperatura ambjentali / 5min
---- Neħħi l-fażi n-hexane tas-supernatant;ħu 50μl tal-fażi akwea tas-sottostrat għall-assaġġ.
Fattur ta' dilwizzjoni: 1
8.2 Ħalib
---- Ħu 100μl ta 'kampjun tal-ħalib nej, ħallat ma' 900μl ta 'soluzzjoni ta' estrazzjoni (soluzzjoni2), u ħawwad kompletament.
---- Ħu 50μl tas-soluzzjoni ppreparata għall-assaġġ.
Fattur ta' dilwizzjoni: 10
9. Proċess ta 'assaġġ
9.1 Avviż qabel l-assaġġ
9.1.1Kun żgur li r-reaġenti u l-mikrowells kollha huma kollha f'temperatura tal-kamra (20-25 ℃).
9.1.2Irritorna r-reaġenti kollha tal-bqija għal 2-8℃immedjatament wara li jintuża.
9.1.3Il-ħasil tal-microwells b'mod korrett huwa pass importanti fil-proċess tal-assaġġ;huwa l-fattur vitali għar-riproduċibbiltà tal-analiżi ELISA.
9.1.4 Avojta d-dawl u għatti l-microwells waqt l-inkubazzjoni.
9.2 Passi tal-Assaġġ
9.2.1 Oħroġ ir-reaġenti kollha f'temperatura tal-kamra (20-25 ℃) għal aktar minn 30min, ħawwad bil-mod qabel l-użu.
9.2.2 Oħroġ il-microwells meħtieġa u rritorna l-bqija fil-borża zip-lock f'2-8℃ immedjatament.
9.2.3 Is-soluzzjoni tal-ħasil dilwita għandha tissaħħan mill-ġdid biex tkun f'temperatura ambjentali qabel l-użu.
9.2.4Numru:Kull pożizzjonijiet tal-mikrowell numerati u l-istandards u l-kampjuni kollha għandhom jitħaddmu f'żewġ kopji.Irreġistra l-istandards u l-pożizzjonijiet tal-kampjuni.
9.2.5Add soluzzjoni/kampjun standard u soluzzjoni ta' antikorp: Żid 50µl ta' soluzzjoni standard((kit ipprovdut)) jew kampjun ippreparat għal bjar korrispondenti.Żid 50µl ta’ soluzzjoni ta’ antikorp (kit ipprovdut).Ħallat bil-mod billi tħawwad il-pjanċa manwalment u inkuba għal 30min f'37℃ b'għatu.
9.2.6Aħsel: Neħħi l-għatu bil-mod u purifika l-likwidu mill-bjar u laħlaħ il-microwells b'250µl soluzzjoni tal-ħasil dilwita (soluzzjoni3) f'intervall ta '10s għal 4-5 darbiet.Assorbi l-ilma residwu b'karta assorbenti (il-bużżieqa ta 'l-arja tal-bqija tista' tiġi eliminata bil-ponta mhux użata).
9.2.7Żid l-enżima konjugat: Żid 100ml ta' soluzzjoni ta' konjugat tal-enżimi (kit ipprovdut) għal kull bir, ħallat bil-mod u inkuba għal 30min f'37℃ b'għatu.Irrepeti l-pass tal-ħasil mill-ġdid.
9.2.8Kulur: Żid 50µl ta’ soluzzjoni A(kit ipprovdut) u 50µl tas-soluzzjoni B(kit ipprovdut) għal kull bir.Ħallat bil-mod u inkuba għal 15-il minuta f'37℃ b'għatu.
9.2.9Miżura: Żid 50µl tas-soluzzjoni ta' waqfien (kit ipprovdut) għal kull bir.Ħallat bil-mod u kejjel l-assorbenza f'450nm (Huwa ssuġġerit miżura bil-wavelength doppju ta '450/630nm. Aqra r-riżultat fi żmien 5min wara li żżid soluzzjoni ta' waqfien).
10. Riżultati
10.1 Assorbenza perċentwali
Il-valuri medji tal-valuri ta' assorbiment miksuba għall-istandards u l-kampjuni huma diviżi bil-valur ta' assorbiment ta' l-ewwel standard (standard żero) u mmultiplikati b'100%.L-istandard żero għalhekk isir ugwali għal 100% u l-valuri ta' assorbiment huma kkwotati f'perċentwali.
B
Assorbenza (%) = —— ×100%
B0
B ——standard ta' assorbiment (jew kampjun)
B0 ——assorbenza żero standard
10.2 Kurva Standard
---- Biex tiġbed kurva standard: Ħu l-valur ta 'assorbiment ta' standards bħala assi y, semi logaritmiku tal-konċentrazzjoni tas-soluzzjoni ta 'standards ta' tylosin (ppb) bħala assi x.
---- Il-konċentrazzjoni ta 'tilosin ta' kull kampjun (ppb), li tista 'tinqara mill-kurva tal-kalibrazzjoni, hija mmultiplikata bil-fattur ta' Dilwizzjoni korrispondenti ta 'kull kampjun segwit, u tinkiseb il-konċentrazzjoni attwali tal-kampjun.
Jekk jogħġbok innota:
softwer speċjali ġie żviluppat għall-analiżi tad-dejta, li jista 'jiġi pprovdut fuq talba.
11. Sensittività, preċiżjoni u preċiżjoni
Sensittività tat-Test:1.5ppb
Limitu ta' skoperta:
Tessut ta 'l-annimali……………………………………… 1.5ppb Ħalib……………………………………………………………………..15ppb Eżattezza:
Tessut tal-annimali………………………………………………80±15%
Ħalib…………………………………..……….……80±10%
Preċiżjoni:
Il-koeffiċjent tal-varjazzjoni tal-kit ELISA huwa inqas minn 10%.
12. Avviż
12.1 Il-valuri medji tal-valuri tal-assorbiment miksuba għall-istandards u l-kampjuni jitnaqqsu jekk ir-reaġenti u l-kampjuni ma jkunux ġew irregolati għat-temperatura tal-kamra (20-25 ℃).
12.2 Tħallix microwells jinxef bejn il-passi biex tiġi evitata riproduċibbiltà bla suċċess u ħaddem il-pass li jmiss immedjatament wara ttektek il-holder tal-microwells.
12.3 Ħawwad kull reaġent bil-mod qabel l-użu.
12.4 Żomm il-ġilda tiegħek 'il bogħod mis-soluzzjoni ta' waqfien għax hija 0.5MH2SO4soluzzjoni.
12.5 Tużax il-kits skaduti.Tiskambjax ir-reaġenti ta 'lottijiet differenti, jew inkella se twaqqa' s-sensittività.
12.6 Żomm il-kits ELISA f'2-8℃, tiffriżax.Issiġilla pjanċi tal-mikrowell tal-mistrieħ, Evita dawl tax-xemx dritt waqt l-inkubazzjonijiet kollha.Il-kisi tal-pjanċi tal-mikrotiter huwa rakkomandat.
12.7 Is-soluzzjoni tas-sottostrat għandha tiġi abbandunata jekk idawwar il-kuluri.Ir-reaġenti jistgħu jduru ħażin jekk il-valur tal-assorbiment (450/630nm) tal-istandard żero huwa inqas minn 0.5 (A450nm <0.5).
12.8 Ir-reazzjoni tal-kulur teħtieġ 15min wara ż-żieda tas-soluzzjoni A u s-soluzzjoni B. U tista 'ttawwal il-firxiet ta' ħin ta 'inkubazzjoni għal 20min jew aktar jekk il-kulur ikun ħafif wisq biex jiġi determinat.Qatt ma taqbeż it-30min, għall-kuntrarju, tqassar il-ħin ta 'inkubazzjoni kif suppost.
12.9 L-aħjar temperatura ta 'reazzjoni hija 37℃.Temperatura ogħla jew aktar baxxa twassal għal bidliet fil-valuri tas-sensittività u l-assorbiment.
13. Ħażna
Kondizzjoni tal-ħażna: 2-8℃.
Perjodu ta 'ħażna: 12-il xahar.
