Flumequine의 정량분석을 위한 Competitive Enzyme Immunoassay Kit
테스트 원리
이 키트는 간접 경쟁 ELISA 기술을 기반으로 합니다.마이크로타이터 웰은 커플링 항원으로 코팅됩니다.플루메퀸샘플의 잔류물은 항체에 대해 마이크로타이터 플레이트에 코팅된 항원과 경쟁합니다.효소 표지된 항항체를 첨가한 후, TMB 기질을 사용하여 색상을 나타냅니다.샘플의 흡광도는 그 안에 존재하는 테트라사이클린과 음의 관계가 있으며 표준 곡선과 비교한 후 희석 배수를 곱하면 샘플의 Flumequine 잔류량을 계산할 수 있습니다.
애플리케이션
이 키트는 벌꿀에 잔류하는 flumequine의 정량 및 정성 분석에 사용할 수 있습니다.
교차 반응
플루메퀸 .................................................................. 100%
필요한 재료
장비
┅┅Microtiter plate spectrophotometer (450nm/630nm)
┅┅균질화기 또는 스토스터
┅┅쉐이커
┅┅볼텍스 믹서
┅┅원심분리기
┅┅분석 저울(인덕턴스: 0.01g)
┅┅눈금 피펫: 15ml
┅┅고무 피펫 전구
┅┅폴리스티렌 원심분리기 튜브: 15ml, 50ml
┅┅유리시험관：10ml
┅┅마이크로피펫: 20ml-200ml, 100ml -10000ml,
250ml - 멀티피펫
시약
┅┅n-헥산(AR)
┅┅메틸렌클로라이드(AR)
┅┅아세토니트릴(AR)
┅┅탈이온수
-----농축 염산(AR)
키트 구성품
● 항원으로 코팅된 96웰의 Microtiter plate
● 표준액(6병×1ml/병)
0ppb, 0.3ppb, 1.2ppb, 4.8ppb, 19.2ppb, 76.8ppb
● 고농도 표준 대조군:(1ml/병)
..................................................................100ppb
● 효소접합체 12ml ......................... 빨간 모자
● 항체액 7ml …
● Solution A 7ml ....................................................백캡
● 솔루션 B 7ml .................................................. 빨간 모자
● 정지용액 7ml .........................................노란색 캡
● 20X농축세척액 40ml
……………………………….투명 캡
●2X Extraction solution 50ml ......................... 파란색 캡
시약 준비
7.1 꿀 샘플
용액 1: 0.2M 염산 용액
무게 41.5ml 진한 염산, 탈 이온수로 희석하여 500ml.
해결책 2: 세척액
농축 세척 용액을 탈이온수로 1:19의 부피 비율로 희석하여 플레이트 세척에 사용합니다.희석액은 4℃에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
해결책3: 추출 용액
시료 추출에 사용할 1:1(또는 요구 사항에 따라 다름)의 부피 비율로 탈이온수로 2× 농축 추출 용액을 희석합니다.이 희석액은 4℃에서 1개월간 보존할 수 있다.
샘플 준비
8.1 사용 전 사용자 주의사항 및 주의사항
(a) 실험 과정에서 일회용 팁을 사용하고 다른 시약을 흡수할 때 팁을 교체하십시오.
(b) 모든 실험 도구가 깨끗한지 확인하십시오. 그렇지 않으면 분석 결과에 영향을 미칩니다.
8.2꿀 샘플
-----2g±0.05g 꿀 샘플을 50ml 폴리스티렌 원심분리기 튜브에 넣고,
----- 0.2M 염산 용액(용액 1) 2ml를 넣고 와동하여 완전히 섞은 다음 메틸렌클로라이드 8ml를 넣고 진탕기로 5분 동안 흔들어 완전히 녹입니다.
-----상온(20-25℃)에서 최소 3000g, 10분간 원심분리;
-----상등액을 제거하고 기질 유기 용액 2ml를 취하여 10ml 유리관에 담는다. 기질을 질소 흐름 수조(50-60℃)에서 건조시킨다.
----- n-헥산 1ml를 넣고 30초 동안 vortex한 후 추출액(3번 용액) 1ml를 넣고 다시 1분간 vortex한다.상온(20~25℃)에서 3000g 이상 5분간 원심분리
-----상등액을 제거하고 분석을 위해 50ml를 취합니다.
9. 분석 과정
9.1 분석 전 주의사항
9.1.1 모든 시약과 마이크로웰은 모두 실온(20~25℃)에 있어야 합니다.
9.1.2 모든 나머지 시약은 사용 후 즉시 2-8℃로 되돌린다.
9.1.3 마이크로웰을 올바르게 세척하는 것은 분석 과정에서 중요한 단계입니다.ELISA 분석의 반복성에 중요한 요소입니다.
9.1.4 배양하는 동안 빛을 피하고 마이크로웰을 덮습니다.
9.2 분석 단계
9.2.1 모든 시약은 실온(20-25℃)에서 30분 이상 꺼내어 균질화한 후 사용한다.
9.2.2 필요한 마이크로웰을 꺼내고 나머지는 즉시 2-8℃의 지퍼백에 다시 넣습니다.
9.2.3 희석된 세척액은 사용하기 전에 상온으로 데워야 합니다.
9.2.4숫자:모든 마이크로웰 위치와 모든 표준 및 샘플에 번호를 매기면 이중으로 실행해야 합니다.표준 및 샘플 위치를 기록합니다.
9.2.5표준 솔루션/샘플 추가:50 µl의 표준 용액 또는 준비된 샘플을 해당 웰에 추가합니다.50µl 항체 솔루션을 추가합니다.플레이트를 수동으로 흔들어 부드럽게 혼합하고 25℃에서 30분 동안 뚜껑을 덮고 배양합니다.
9.2.6씻다:부드럽게 커버를 제거하고 웰에서 액체를 순수하게 하고 마이크로웰을 250µl의 희석된 세척 용액(용액 2)으로 10초 간격으로 4-5회 헹굽니다.흡수지로 남은 수분을 흡수합니다(남은 기포는 사용하지 않은 팁으로 제거할 수 있습니다).
9.2.8.효소 컨쥬게이트:각 well에 효소결합액 100ml를 넣고 손으로 흔들어 부드럽게 섞은 후 뚜껑을 덮고 25℃에서 30분간 반응시킨다.세척 단계를 다시 반복하십시오.
9.2.8천연색:50µl 용액 A와 50µl 용액 B를 각 웰에 추가합니다.플레이트를 수동으로 흔들어서 부드럽게 혼합하고 덮개를 덮고 25℃에서 15분 동안 배양합니다(12.8 참조).
9.2.9측정하다:각 웰에 정지 용액 50µl를 추가합니다.Plate를 손으로 가볍게 흔들어 섞은 후 air blank에 대해 450nm에서 흡광도를 측정한다. ELIASA 기기에 비해 정지 솔루션 없음)
결과
10.1 백분율 흡광도
표준물질과 시료에 대해 얻은 흡광도 값의 평균값을 첫 번째 표준물질(제로 표준물질)의 흡광도 값으로 나누고 100%를 곱합니다.따라서 제로 표준은 100%와 같게 만들고 흡광도 값은 백분율로 표시됩니다.
흡광도(%) = B/B0 ×100%
B ——흡광도 표준(또는 시료)
B0 ——흡광도 영점 기준
10.2 표준 곡선
표준 곡선을 그리려면: 표준의 흡광도 값을 y축으로, flumequine 표준 용액(ppb) 농도의 반로그를 x축으로 합니다.
---플루메퀸검량선에서 읽을 수 있는 각 샘플의 농도(ppb)에 각 샘플의 해당 희석배수를 곱하여 샘플의 실제 농도를 얻습니다.
ELISA 키트의 데이터 축소를 위해 요청 시 제공할 수 있는 특수 소프트웨어가 개발되었습니다.
11. 감도, 정확도 및 정밀도
테스트 감도：0.3ppb
허니 샘플 희석 배율: 2
검출 한계
꿀 샘플------------------------------------------------ -1ppb
정확성
꿀 샘플 --------------------------------------------- 90±20 %
정도
ELISA 키트의 변동 계수는 10% 미만입니다.
12. 공지사항
12.1 시약과 시료가 실온(20-25℃)으로 조절되지 않으면 표준물질과 시료에 대해 얻은 흡광도 값의 평균값이 감소합니다.
12.2 실패한 반복을 방지하기 위해 단계 사이에 마이크로웰이 건조되지 않도록 하고 마이크로웰 홀더를 탭한 직후 다음 단계를 작동합니다.
12.3.사용하기 전에 각 시약을 균질화하십시오.
12.4.스톱 솔루션에서 피부를 멀리 유지하십시오. 2M H2SO4해결책.
12.5 오래된 키트를 사용하지 마십시오.다른 배치의 시약을 교환하지 마십시오. 감도가 떨어집니다.
12.6 보관 조건:
ELISA 키트를 2-8℃에 보관하고 동결하지 마십시오.나머지 마이크로웰 플레이트를 밀봉하십시오. 모든 배양 동안 직사광선을 피하십시오.마이크로타이터 플레이트를 덮는 것이 좋습니다.
12.7 불량 시약에 대한 징후:
기질 용액이 변색되면 버려야 합니다.
제로 표준의 흡광도 값(450/630nm)이 0.5 미만(A450nm＜0.5)이면 시약이 불량이 될 수 있습니다.
12.8 Solution A와 Solution B를 첨가한 후 발색 반응은 15분이 소요된다. 그리고 색상이 너무 옅어서 판단할 수 없을 경우 배양 시간 범위를 20분에서 그 이상으로 연장할 수 있다.절대 25분을 초과하지 말고, 반대로 부화 시간을 적절하게 줄이십시오.
12.9 최적 반응온도는 25℃이다.온도가 높거나 낮으면 감도 및 흡광도 값이 변경됩니다.
13. 보관
보관 조건: 2-8℃.
보관 기간: 12개월.
