フルメキン定量分析用競合酵素免疫測定キット
試験原理
このキットは、間接競合 ELISA 技術に基づいています。マイクロタイターウェルは結合抗原でコーティングされています。フルメキンサンプル中の残留物は、抗体を求めてマイクロタイター プレートにコーティングされた抗原と競合します。酵素標識抗抗体を添加した後、TMB基質を使用して色を表示します。サンプルの吸光度は、その中に存在するテトラサイクリンに負の相関があり、標準曲線と比較した後、希釈倍数を掛けて、サンプル中のフルメキン残留量を計算できます。
アプリケーション
このキットは、蜂蜜中のフルメキン残留物の定量および定性分析に使用できます。
交差反応
フルメキン …………………..……………………… 100%
必要な材料
設備
┅┅マイクロタイタープレート分光光度計（450nm/630nm）
┅┅ホモジナイザーまたはストマッカー
┅┅シェイカー
┅┅ボルテックスミキサー
┅┅遠心機
┅┅分析天秤（インダクタンス：0.01g）
┅┅目盛り付きピペット：15ml
┅┅ラバーピペットバルブ
┅┅ポリスチレン遠沈管：15ml、50ml
┅┅ガラス試験管：10ml
┅┅マイクロピペット：20ml～200ml、100ml～10000ml、
250ml マルチピペット
試薬
┅┅n-ヘキサン(AR)
┅┅塩化メチレン(AR)
┅┅アセトニトリル(AR)
┅┅純水
-----濃塩酸(AR)
キットの構成要素
● 抗原でコーティングされた 96 ウェルのマイクロタイター プレート
●標準液（6本×1ml/本）
0ppb、0.3ppb、1.2ppb、4.8ppb、19.2ppb、76.8ppb
●高濃度スタンダードコントロール：(1ml/本)
……………………………………………………100ppb
●酵素複合体 12ml………………………………赤キャップ
●抗体溶液 7ml …………..……..….…..緑キャップ
●Solution A 7ml………………………………..…………..白キャップ
●Solution B 7ml ……………….…………..………… 赤キャップ
●Stop solution 7ml ……………………..………黄キャップ
●20倍濃縮洗浄液 40ml
……………………………………..…..透明キャップ
●2倍抽出液 50ml…………………………青キャップ
試薬の準備
7.1 蜂蜜サンプル
溶液 1 : 0.2 M 塩酸溶液
重量 41.5ml 濃塩酸、脱イオン水で 500ml に希釈。
解決策 2: 洗浄液
プレートを洗浄するために使用される 1:19 の体積比で脱イオン水で濃縮洗浄液を希釈します。希釈液は4℃で1ヶ月保存可能です。
解決3: 抽出液
サンプル抽出に使用される 1:1 の容積比で脱イオン水で 2 倍の濃縮抽出溶液を希釈します (または要件によって異なります)。この希釈液は4℃で1ヶ月保存できます。
サンプルの準備
8.1 操作前のユーザーへの通知と注意事項
(a) 実験の過程で 1 回限りのチップを使用し、異なる試薬を吸収する場合はチップを交換してください。
(b) すべての実験器具が清潔であることを確認してください。そうしないと、アッセイ結果に影響します。
8.2蜂蜜サンプル
----- 2g±0.05g のハチミツサンプルを 50ml のポリスチレン遠心管に量り取り、
-----2mlの0.2M塩酸溶液（溶液1）を加え、ボルテックスして完全に混合し、8mlの塩化メチレンを加え、シェーカーで5分間振って完全に溶解します。
-----室温（20～25℃）で3000g以上、10分間遠心分離します。
-----上澄み相を取り除き、基質有機溶液 2ml を 10ml ガラス管に取り、窒素流の水浴 (50-60℃) で基質を乾燥させます。
-----1mlのn-ヘキサンを加え、30秒間ボルテックスし、次に1mlの抽出溶液（溶液3）を加え、再度1分間ボルテックスします。室温（20～25℃）で3000g以上、5分間遠心する。
-----上澄み相を取り除き、アッセイのために 50ml を取ります。
9. アッセイ プロセス
9.1 アッセイ前の注意事項
9.1.1 すべての試薬とマイクロウェルがすべて室温 (20 ～ 25℃) であることを確認します。
9.1.2 残りの試薬は、使用後すぐに 2～8℃に戻してください。
9.1.3 マイクロウェルを正しく洗浄することは、アッセイのプロセスにおける重要なステップです。これは、ELISA 分析の反復性にとって重要な要素です。
9.1.4 インキュベーション中は光を避け、マイクロウェルをカバーしてください。
9.2 アッセイ手順
9.2.1 すべての試薬を室温 (20 ～ 25℃) で 30 分以上取り出し、使用前にホモジナイズします。
9.2.2 必要なマイクロウェルを取り出し、残りを 2 ～ 8℃のジップロックバッグにすぐに戻します。
9.2.3 希釈した洗浄溶液は、使用前に室温に戻す必要があります。
9.2.4番号：すべてのマイクロウェル位置に番号を付け、すべての標準とサンプルを重複して実行する必要があります。標準とサンプルの位置を記録します。
9.2.5標準溶液/サンプルを追加:50 μl の標準溶液または調製済みサンプルを対応するウェルに加えます。50μlの抗体溶液を追加します。プレートを手で軽く振って混合し、蓋をして 25℃で 30 分間インキュベートします。
9.2.6ウォッシュ:カバーを静かに取り外し、ウェルから液体を取り除き、マイクロウェルを 250µl の希釈洗浄液 (溶液 2) で 10 秒間隔で 4 ～ 5 回リンスします。吸収紙で残りの水を吸収します (残りの気泡は未使用のチップで除去できます)。
9.2.8.酵素コンジュゲート:酵素複合体溶液 100ml を各ウェルに加え、プレートを手で軽く振って混合し、蓋をして 25℃で 30 分間インキュベートします。洗浄ステップをもう一度繰り返します。
9.2.8着色:50μl の溶液 A と 50μl の溶液 B を各ウェルに加えます。プレートを手で振って静かに混合し、蓋をして 25℃で 15 分間インキュベートします (12.8 参照)。
9.2.9測定：各ウェルに50μlの停止液を追加します。プレートを手で軽く振って混合し、空気ブランクに対して 450nm での吸光度を測定します (450/630nm の 2 波長で測定することをお勧めします。停止液の添加後 5 分以内に結果を読み取ります。) (目視で測定することもできます。) ELIASA 機器の短い停止液なし)
結果
10.1 パーセンテージ吸光度
標準およびサンプルについて得られた吸光度値の平均値を、最初の標準 (ゼロ標準) の吸光度値で割り、100% を掛けます。したがって、ゼロ標準は 100% に等しくなり、吸光度の値はパーセンテージで示されます。
吸光度 (%) = B/B0 ×100%
B —— 吸光度標準 (またはサンプル)
B0 ——吸光度ゼロ標準
10.2 標準曲線
標準曲線を描くには: 標準の吸光度値を y 軸、フルメキン標準溶液の濃度 (ppb) の片対数を x 軸に取ります。
---フルメキン検量線から読み取ることができる各サンプルの濃度 (ppb) に、各サンプルの対応する希釈倍数を掛けて、サンプルの実際の濃度を取得します。
ELISA キットのデータ削減のために特別なソフトウェアが開発されており、ご要望に応じて提供することができます。
11. 感度、精度、精度
テスト感度：0.3ppb
はちみつ サンプル希釈倍率: 2
検出限界
はちみつサンプル------------------------------------------------ -1ppb
正確さ
はちみつサンプル ---------------------------------------------- 90±20 %
精度
ELISAキットの変動係数は10%未満です。
12. 通知
12.1 試薬およびサンプルが室温 (20 ～ 25℃) に調整されていない場合、標準およびサンプルについて得られた吸光度値の平均値は減少します。
12.2 ステップ間でマイクロウェルを乾燥させないでください。これにより、反復の失敗を回避し、マイクロウェル ホルダーをタップした直後に次のステップを操作します。
12.3.使用前に各試薬をホモジナイズしてください。
12.4.停止液は 2M H であるため、肌を遠ざけてください。2SO4解決。
12.5 期限切れのキットを使用しないでください。異なるバッチの試薬を交換しないでください。感度が低下します。
12.6 保管条件:
ELISA キットは 2～8℃で保存し、凍結しないでください。残りのマイクロウェル プレートをシールします。 すべてのインキュベーション中、直射日光を避けてください。マイクロタイター プレートをカバーすることをお勧めします。
12.7 試薬の劣化の兆候:
基質液が変色した場合は廃棄してください。
ゼロスタンダードの吸光度（450/630nm）が0.5未満（A450nm＜0.5）の場合、試薬が劣化している可能性があります。
12.8 Solution A と Solution B を加えた後、発色反応には 15 分間必要です。25分を超えないように注意してください。逆に、インキュベーション時間は適切に短くしてください。
12.9 至適反応温度は25℃です。温度が高いまたは低いと、感度と吸光度の値が変化します。
13.保管
保管条件：2～8℃。
保管期間：12ヶ月。
