टाइलोसिन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए प्रतिस्पर्धी एंजाइम इम्यूनोएसे किट
के लिए प्रतिस्पर्धी एंजाइम इम्यूनोएसे किट
का मात्रात्मक विश्लेषणटाइलोसिन
1। पृष्ठभूमि
टाइलोसिनएक मैक्रोलाइड एंटीबायोटिक है, जिसे मुख्य रूप से जीवाणुरोधी और एंटी-माइकोप्लाज्मा के रूप में लगाया जाता है।सख्त एमआरएल स्थापित किए गए हैं क्योंकि यह दवा कुछ समूहों में गंभीर दुष्प्रभाव पैदा कर सकती है।
यह किट एलिसा तकनीक पर आधारित एक नया उत्पाद है, जो सामान्य उपकरण विश्लेषण की तुलना में तेज़, आसान, सटीक और संवेदनशील है और एक ऑपरेशन में केवल 1.5 घंटे की आवश्यकता होती है, यह ऑपरेशन की त्रुटि और कार्य की तीव्रता को काफी कम कर सकता है।
2. परीक्षण सिद्धांत
यह किट अप्रत्यक्ष-प्रतिस्पर्धी एलिसा तकनीक पर आधारित है।माइक्रोटिटर कुओं को कपलिंग एंटीजन के साथ लेपित किया जाता है।नमूने में टाइलोसिन अवशेष एंटीबॉडी के लिए माइक्रोटिटर प्लेट पर लेपित एंटीजन के साथ प्रतिस्पर्धा करता है।एंटी-एंटीबॉडी लेबल वाले एंजाइम को जोड़ने के बाद, रंग दिखाने के लिए टीएमबी सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है।नमूने का अवशोषण नकारात्मक रूप से उसमें रहने वाले टाइलोसिन से संबंधित है, मानक वक्र के साथ तुलना करने के बाद, कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा करके, नमूने में टाइलोसिन अवशेषों की मात्रा की गणना की जा सकती है।
3. अनुप्रयोग
इस किट का उपयोग पशु ऊतक (चिकन, सूअर का मांस, बत्तख) और दूध, शहद, अंडा, आदि में टायलोसीन अवशेषों के मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण में किया जा सकता है।
4. क्रॉस-रिएक्शन
टाइलोसिन …………………………………………… ..100%
टिल्मीकोसिन ………………………………………… <2%
5. आवश्यक सामग्री
5.1 उपकरण:
---- माइक्रोटिटर प्लेट स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (450nm/630nm)
---- रोटरी बाष्पीकरण या नाइट्रोजन सुखाने के उपकरण
---- होमोजेनाइज़र
---- शेखर
---- अपकेंद्रित्र
----विश्लेषणात्मक संतुलन (अधिष्ठापन: 0.01g)
---- स्नातक की उपाधि प्राप्त पिपेट: 10 मि.ली
---- रबर पिपेट बल्ब
---- वॉल्यूमेट्रिक फ्लास्क: 10 मि.ली
---- पॉलीस्टीरिन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब: 50 मिली
---- माइक्रोपाइपेट्स: 20-200 मिली, 100-1000 मिली
250 मिली-मल्टीपिपेट
5.2 अभिकर्मक:
----सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH, AR)
----सोडियम बाइकार्बोनेट (NaHCO3,एआर)
---- सोडियम कार्बोनेट (NaCO3, एआर)
---- ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड (AR)
---- एसीटोनिट्रिल (एआर)
---- एथिल एसीटेट (AR)
┅┅एन-हेक्सेन (एआर)
----विआयनीकृत पानी
6. किट घटक
एल एंटीजन के साथ लेपित 96 कुओं के साथ माइक्रोटिटर प्लेट
एल मानक समाधान (5 बोतलें, 1 मिली / बोतल)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
एल स्पाइकिंग मानक नियंत्रण: (1 मिली/बोतल)1 पीपीएम
एल एंजाइम संयुग्म 1ml……………………………..लाल टोपी
एल एंटीबॉडी समाधान 7ml…………………………हरी टोपी
एल समाधान एक 7ml …………………………… सफेद टोपी
एल समाधान बी 7 मिलीलीटर …………………………… .. लाल टोपी
एल स्टॉप सॉल्यूशन 7 मिली ………………………पीली टोपी
एल 20 × केंद्रित धो समाधान 40 मि.ली
…………………………………………..पारदर्शी टोपी
एल 4 × केंद्रित निष्कर्षण समाधान 50 मि.ली
………………………………………। नीली टोपी
7. अभिकर्मकों की तैयारी:
समाधान 1:0.1mol/L NaOH समाधान
0.4 ग्राम NaOH से 100 मिलीलीटर विआयनीकृत पानी तोलें और पूरी तरह मिलाएं।
समाधान 2: 1mol/L NaOH घोल
4g NaOH से 100ml विआयनीकृत पानी तोलें और पूरी तरह मिलाएँ।
समाधान 3: कार्बोनेट बफर नमक
समाधान1: 0.2 एम पीबी
ना के 51.6g भंग2एचपीओ4· 12 एच2हे, NaH का 8.7 ग्राम2PO4· 2एच2ओ विआयनीकृत पानी के साथ और 1000 मिलीलीटर तक पतला।
समाधान2: निष्कर्षण समाधान
1:1 के आयतन अनुपात में विआयनीकृत पानी के साथ 2 × केंद्रित निष्कर्षण समाधान को पतला करें (उदाहरण के लिए 2×निष्कर्षण विलयन का 10 मि.ली. + विआयनीकृत जल का 10 मि.ली), जिसका उपयोग नमूना निष्कर्षण के लिए किया जाएगा,इस घोल को 1 महीने के लिए 4 ℃ पर संग्रहित किया जा सकता है.
समाधान3: घोल को धो लें
1:19 के आयतन अनुपात में विआयनीकृत पानी के साथ 20 × केंद्रित धोने के घोल को पतला करें (उदाहरण के लिए 20×धोने के घोल का 5 मि.ली. + विआयनीकृत पानी का 95 मि.ली), जिसका उपयोग प्लेट धोने के लिए किया जाएगा।इस घोल को 1 महीने के लिए 4 ℃ पर संग्रहित किया जा सकता है.
8. नमूना तैयार करना
8.1 ऑपरेशन से पहले नोटिस और सावधानियां:
(ए) कृपया प्रयोग की प्रक्रिया में एक-बंद युक्तियों का उपयोग करें, और विभिन्न अभिकर्मकों को अवशोषित करते समय युक्तियों को बदलें।
(बी) सुनिश्चित करें कि सभी उपकरण साफ हैं।
(सी) ऊतक के नमूने को फ्रीज में रखें।
(डी) तैयार नमूना एक बार में परख के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
8.2 पशु ऊतक (मुर्गी, सूअर का मांस, आदि)
---- होमोजिनेज़र के साथ नमूना को समरूप बनाएं;
---- 50 मिली पॉलीस्टाइन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 2.0 ± 0.05 ग्राम होमोजेनेट लें;0.2 एम पीबी के 2 मिलीलीटर जोड़ें (उपाय1), घुलने के लिए हिलाएं, और फिर 8 मिली एथिल एसीटेट डालें और 3 मिनट तक जोर से हिलाएं;
---- जुदाई के लिए अपकेंद्रित्र: 3000 ग्राम / परिवेश का तापमान / 5 मिनट।
---- सतह पर तैरनेवाला कार्बनिक चरण के 4 मिलीलीटर को 10 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब में स्थानांतरित करें, नाइट्रोजन गैस धारा के तहत 50-60 ℃ पानी के स्नान के साथ सूखा;
---- सूखे बचे हुए को 1 मिली एन-हेक्सेन के साथ घोलें, भंवर को 30 एस तक भंग करने के लिए, और फिर 1 मिली निष्कर्षण घोल डालें (उपाय2), 1 मिनट के लिए भंवर।जुदाई के लिए सेंट्रीफ्यूज: 3000 ग्राम / परिवेश का तापमान / 5 मिनट
---- सतह पर तैरनेवाला n-hexane चरण निकालें;परख के लिए सब्सट्रेट जलीय चरण का 50μl लें।
कमजोर पड़ने का कारक: 1
8.2 दूध
---- 100μl कच्चे दूध का नमूना लें, 900μl निष्कर्षण समाधान के साथ मिलाएं (उपाय2), और पूरी तरह मिलाएं।
---- परख के लिए तैयार घोल का 50μl लें।
कमजोर पड़ने का कारक: 10
9. परख प्रक्रिया
9.1 परख से पहले नोटिस
9.1.1सुनिश्चित करें कि सभी अभिकर्मक और माइक्रोवेल कमरे के तापमान (20-25 ℃) पर हैं।
9.1.2बाकी सभी अभिकर्मकों को 2-8 पर लौटाएँ℃इस्तेमाल के तुरंत बाद।
9.1.3माइक्रोवेल्स को सही तरीके से धोना परख की प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण कदम है;यह एलिसा विश्लेषण की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता के लिए महत्वपूर्ण कारक है।
9.1.4 एऊष्मायन के दौरान प्रकाश को शून्य करें और माइक्रोवेल्स को कवर करें।
9.2 परख कदम
9.2.1 कमरे के तापमान (20-25 ℃) पर 30 मिनट से अधिक के लिए सभी अभिकर्मकों को बाहर निकालें, उपयोग से पहले धीरे से हिलाएं।
9.2.2 आवश्यक माइक्रोवेल्स को बाहर निकालें और बाकी को जिप-लॉक बैग में 2-8 ℃ पर तुरंत वापस कर दें।
9.2.3 पतला धोने के घोल को उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर फिर से गर्म करना चाहिए।
9.2.4संख्या:क्रमांकित प्रत्येक माइक्रोवेल स्थिति और सभी मानकों और नमूनों को दो प्रतियों में चलाया जाना चाहिए।मानकों और नमूनों की स्थिति को रिकॉर्ड करें।
9.2.5Aडीडी मानक समाधान / नमूना और एंटीबॉडी समाधान: मानक समाधान के 50μl जोड़ें ((किट प्रदान की)) या इसी कुओं के लिए तैयार नमूना।एंटीबॉडी समाधान के 50μl जोड़ें (किट प्रदान की).प्लेट को मैन्युअल रूप से हिलाकर धीरे से मिलाएं और कवर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
9.2.6धोना: कवर को धीरे से हटाएं और कुओं से तरल को शुद्ध करें और माइक्रोवेल्स को 250μl पतला धोने के घोल से धोएं (उपाय3) 10s के अंतराल पर 4-5 बार।शोषक कागज के साथ अवशिष्ट पानी को अवशोषित करें (बाकी हवा के बुलबुले को अप्रयुक्त टिप के साथ समाप्त किया जा सकता है)।
9.2.7एंजाइम संयुग्म जोड़ें: एंजाइम संयुग्म समाधान के 100 मिलीलीटर जोड़ें (किट प्रदान की) प्रत्येक कुएं में, धीरे से मिलाएं और कवर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।वॉश स्टेप को फिर से दोहराएं.
9.2.8रंगाई: 50μl विलयन A(किट प्रदान की) और समाधान बी के 50μl (किट प्रदान की) प्रत्येक कुएं के लिए।धीरे से मिलाएं और कवर के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
9.2.9मापना: स्टॉप सॉल्यूशन के 50μl जोड़ें (किट प्रदान की) प्रत्येक कुएं के लिए।धीरे से मिलाएं और 450nm पर अवशोषण को मापें (यह 450/630nm की दोहरी-तरंग दैर्ध्य के साथ सुझाए गए उपाय हैं। स्टॉप सॉल्यूशन जोड़ने के बाद 5 मिनट के भीतर परिणाम पढ़ें)।
10. परिणाम
10.1 प्रतिशत अवशोषण
मानकों और नमूनों के लिए प्राप्त अवशोषक मूल्यों के औसत मूल्यों को पहले मानक (शून्य मानक) के अवशोषण मूल्य से विभाजित किया जाता है और 100% से गुणा किया जाता है।शून्य मानक इस प्रकार 100% के बराबर बना दिया जाता है और अवशोषण मान प्रतिशत में उद्धृत किए जाते हैं।
B
अवशोषण (%) = —— × 100%
B0
बी --- अवशोषक मानक (या नमूना)
B0 ——अवशोषण शून्य मानक
10.2 मानक वक्र
---- एक मानक वक्र बनाने के लिए: मानकों के अवशोषण मान को y-अक्ष के रूप में लें, tylosin मानक समाधान (ppb) की सांद्रता के अर्ध लघुगणक को x-अक्ष के रूप में लें।
---- प्रत्येक नमूने (पीपीबी) की टिलोसिन सांद्रता, जिसे अंशांकन वक्र से पढ़ा जा सकता है, को प्रत्येक नमूने के संबंधित कमजोर पड़ने वाले कारक से गुणा किया जाता है, और नमूने की वास्तविक एकाग्रता प्राप्त की जाती है।
कृपया ध्यान दें:
डेटा विश्लेषण के लिए विशेष सॉफ्टवेयर विकसित किया गया है, जिसे अनुरोध पर प्रदान किया जा सकता है।
11. संवेदनशीलता, सटीकता और सटीकता
परीक्षण संवेदनशीलता:1.5ppb
पहचान सीमा:
पशु ऊतक ……………………………………… 1.5ppb दूध ………………………………………………………..15ppb शुद्धता:
पशु ऊतक ………………………………………… 80 ± 15%
दूध …………………………………..…………80±10%
शुद्धता:
एलिसा किट का भिन्नता गुणांक 10% से कम है।
12. सूचना
12.1 यदि अभिकर्मकों और नमूनों को कमरे के तापमान (20-25 ℃) तक विनियमित नहीं किया गया है, तो मानकों और नमूनों के लिए प्राप्त अवशोषण मूल्यों का माध्य मान कम हो जाएगा।
12.2 माइक्रोवेल्स को असफल पुनरुत्पादन से बचने के लिए चरणों के बीच सूखने की अनुमति न दें और माइक्रोवेल्स होल्डर को टैप करने के तुरंत बाद अगले चरण को संचालित करें।
12.3 उपयोग करने से पहले प्रत्येक अभिकर्मक को धीरे से हिलाएं।
12.4 अपनी त्वचा को स्टॉप सॉल्यूशन से दूर रखें क्योंकि यह 0.5MH है2SO4उपाय।
12.5 पुरानी किट का उपयोग न करें।विभिन्न बैचों के अभिकर्मकों का आदान-प्रदान न करें, अन्यथा यह संवेदनशीलता को गिरा देगा।
12.6 एलिसा किट को 2-8 ℃ पर रखें, फ्रीज न करें।बाकी माइक्रोवेल प्लेट्स को सील करें, सभी इनक्यूबेशन के दौरान सीधे धूप से बचें।माइक्रोटिटर प्लेट्स को कवर करने की सिफारिश की जाती है।
12.7 अधःस्तर विलयन का रंग बदलने पर उसे छोड़ देना चाहिए।यदि शून्य मानक का अवशोषण मान (450/630nm) 0.5 (A450nm <0.5) से कम है तो अभिकर्मक खराब हो सकते हैं।
12.8 विलयन A और विलयन B मिलाने के बाद रंगीकरण प्रतिक्रिया को 15 मिनट की आवश्यकता होती है। और यदि रंग निर्धारित करने के लिए बहुत हल्का है तो आप ऊष्मायन समय को 20 मिनट या उससे अधिक तक बढ़ा सकते हैं।कभी भी 30 मिनट से अधिक न हो, इसके विपरीत, ऊष्मायन समय को ठीक से छोटा करें।
12.9 इष्टतम प्रतिक्रिया तापमान 37 ℃ है।उच्च या निम्न तापमान से संवेदनशीलता और अवशोषण मूल्यों में परिवर्तन होगा।
13. भंडारण
भंडारण की स्थिति: 2-8 ℃।
भंडारण अवधि: 12 महीने.
