Konkurrencedygtigt enzymimmunoassay-kit til kvantitativ analyse af tylosin
Konkurrencedygtigt enzymimmunoassay-kit til
Kvantitativ analyse afTylosin
1. Baggrund
Tylosiner et makrolidantibiotikum, som hovedsageligt anvendes som antibakteriel og anti-mycoplasma.Der er etableret strenge MRL'er, da dette lægemiddel kan føre til alvorlige bivirkninger i visse grupper.
Dette kit er et nyt produkt baseret på ELISA-teknologi, som er hurtigt, nemt, præcist og følsomt sammenlignet med almindelig instrumentel analyse og kun behøver 1,5 time i én operation, det kan minimere betjeningsfejl og arbejdsintensitet betragteligt.
2. Testprincip
Dette sæt er baseret på indirekte konkurrencedygtig ELISA-teknologi.Mikrotiterbrøndene er belagt med koblingsantigen.Tylosinrest i prøven konkurrerer med antigenet, der er coatet på mikrotiterpladen, om antistoffet.Efter tilsætning af enzymmærket anti-antistof bruges TMB-substrat til at vise farven.Absorbansen af prøven er negativt relateret til den tylosin, der findes i den, efter sammenligning med standardkurven, ganget med fortyndingsfaktoren, kan tylosinrestmængden i prøven beregnes.
3. Ansøgninger
Dette sæt kan bruges til kvantitativ og kvalitativ analyse af tylosinrester i dyrevæv (kylling, svinekød, and) og mælk, honning, æg osv.
4. Krydsreaktioner
Tylosin………………………………………………………..100 %
Tilmicosin………………………………………………………<2 %
5. Nødvendige materialer
5.1 Udstyr:
---- Mikrotiterpladespektrofotometer (450nm/630nm)
---- Rotationsfordamper eller nitrogentørringsinstrumenter
---- homogenisator
----Shaker
---- Centrifuge
----Analytisk balance (induktans: 0,01g)
---- Graduerede pipette: 10ml
---- Gummi pipette pære
----Volumetrisk kolbe: 10ml
----Polystyren centrifugerør: 50ml
----Mikropipetter: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml multipipette
5.2 Reagenser:
----Natriumhydroxid (NaOH, AR)
---- Natriumbicarbonat (NaHCO3,AR)
---- Natriumcarbonat (NaCO3, AR)
----Trichloreddikesyre (AR)
---- Acetonitril (AR)
---- Ethylacetat (AR)
┅┅n-hexan (AR)
----Deioniseret vand
6. Kitkomponenter
l Mikrotiterplade med 96 brønde belagt med antigen
l Standardopløsninger (5 flasker, 1 ml/flaske)
0ppb, 0.5ppb, 1.5ppb, 4.5ppb, 13.5ppb
l Spiking standard kontrol: (1 ml/flaske)1 ppm
l Enzymkonjugat 1ml…………………..…..…rød hætte
l Antistofopløsning 7ml……………….……grøn hætte
l Opløsning A 7ml………………………….….……hvid låg
l Opløsning B 7ml…………………………………..rød låg
l Stopopløsning 7ml.……………….……….gul hætte
l 20×koncentreret vaskeopløsning 40ml
…………………………………..…gennemsigtig hætte
l 4×koncentreret ekstraktionsopløsning 50ml
……………………………………………….blå hætte
7. Forberedelse af reagenser:
Løsning 1:0,1 mol/L NaOH-opløsning
Vej 0,4 g NaOH til 100 ml deioniseret vand og bland fuldstændigt.
Løsning 2: 1mol/L NaOH-opløsning
Vej 4 g NaOH til 100 ml deioniseret vand og bland fuldstændigt.
Løsning 3: Carbonatbuffersalt
Løsning1: 0,2M PB
Opløs 51,6 g Na2HPO4·12H2O, 8,7 g NaH2PO4·2H2O med deioniseret vand og fortynd til 1000 ml.
Løsning2: Ekstraktionsopløsning
Fortynd den 2×koncentrerede ekstraktionsopløsning med deioniseret vand i volumenforholdet 1:1(fx 10ml 2×ekstraktionsopløsning + 10ml deioniseret vand), som vil blive brugt til prøveekstraktion,denne opløsning kan opbevares ved 4 ℃ i 1 måned.
Løsning3: Vaskeopløsning
Fortynd den 20×koncentrerede vaskeopløsning med deioniseret vand i volumenforholdet 1:19(fx 5ml 20×vaskeopløsning + 95ml deioniseret vand), som skal bruges til vask af pladerne.Denne opløsning kan opbevares ved 4 ℃ i 1 måned.
8. Prøveforberedelser
8.1 Meddelelse og forholdsregler før brug:
(a) Brug venligst engangsspidser i forsøgsprocessen, og skift spidserne, når de absorberer forskellige reagenser.
(b) Sørg for, at alle instrumenter er rene.
(c) Opbevar vævsprøven i frysen.
(d) Forberedt prøve skal bruges til analyse med det samme.
8.2 Dyrevæv (kylling, svinekød osv.)
---- Homogeniser prøven med homogenisator;
----Tag 2,0±0,05 g homogenat ind i et 50 ml polystyrencentrifugerør;tilsæt 2ml 0,2M PB (løsning1), ryst for at opløse, og tilsæt derefter 8 ml ethylacetat og ryst kraftigt i 3 minutter;
----Centrifuge til adskillelse: 3000g / omgivelsestemperatur / 5min.
---- Overfør 4 ml af supernatantens organiske fase til et 10 ml glasrør, tør med 50-60 ℃ vandbad under nitrogengasstrøm;
---- Opløs den tørre rest med 1 ml n-hexan, vortex i 30 sekunder for at opløse, og tilsæt derefter 1 ml ekstraktionsopløsning (løsning2), vortex i 1 min.centrifuge til adskillelse: 3000g / omgivelsestemperatur / 5min
---- Fjern supernatanten n-hexanfase;tage 50 μl af substratets vandige fase til analyse.
Fortyndingsfaktor: 1
8.2 Mælk
----Tag 100 μl rå mælkeprøve, bland med 900 μl ekstraktionsopløsning (løsning2), og bland helt.
----Tag 50μl af den forberedte opløsning til analyse.
Fortyndingsfaktor: 10
9. Assayproces
9.1 Meddelelse før assay
9.1.1Sørg for, at alle reagenser og mikrobrønde er ved stuetemperatur (20-25 ℃).
9.1.2Returner alle de resterende reagenser til 2-8℃umiddelbart efter brug.
9.1.3Korrekt vask af mikrobrøndene er et vigtigt trin i analysen;det er den afgørende faktor for reproducerbarheden af ELISA-analysen.
9.1.4 Atøm lyset og dæk mikrobrøndene under inkubation.
9.2 Analysetrin
9.2.1 Tag alle reagenser ud ved stuetemperatur (20-25 ℃) i mere end 30 minutter, ryst forsigtigt før brug.
9.2.2 Få de nødvendige mikrobrønde ud og læg resten tilbage i zip-lock-posen ved 2-8 ℃ med det samme.
9.2.3 Den fortyndede vaskeopløsning skal genopvarmes til stuetemperatur før brug.
9.2.4Nummer:Nummereret hver mikrobrøndpositioner, og alle standarder og prøver skal køres i to eksemplarer.Registrer standarderne og prøvepositionerne.
9.2.5Add standardopløsning/prøve og antistofopløsning: Tilsæt 50 µl standardopløsning ((kit medfølger)) eller forberedt prøve til tilsvarende brønde.Tilsæt 50 µl antistofopløsning (kit medfølger).Bland forsigtigt ved at ryste pladen manuelt og inkuber i 30 minutter ved 37 ℃ med låg.
9.2.6Vask: Fjern forsigtigt låget og rens væsken ud af brøndene og skyl mikrobrøndene med 250 µl fortyndet vaskeopløsning (løsning3) med et interval på 10 s i 4-5 gange.Absorber det resterende vand med absorberende papir (restluftboblen kan fjernes med ubrugt spids).
9.2.7Tilføj enzymkonjugat: Tilsæt 100 ml enzymkonjugatopløsning (kit medfølger) til hver brønd, bland forsigtigt og inkuber i 30 minutter ved 37 ℃ med låg.Gentag vasketrinnet igen.
9.2.8Farvning: Tilsæt 50 µl opløsning A(kit medfølger) og 50 µl opløsning B(kit medfølger) til hver brønd.Bland forsigtigt og inkuber i 15 minutter ved 37 ℃ med låg.
9.2.9Måle: Tilsæt 50 µl af stopopløsningen (kit medfølger) til hver brønd.Bland forsigtigt og mål absorbansen ved 450 nm (det foreslås at måle med den dobbelte bølgelængde på 450/630 nm. Læs resultatet inden for 5 minutter efter tilsætning af stopopløsning).
10. Resultater
10.1 Procent absorbans
Middelværdierne af absorbansværdierne opnået for standarderne og prøverne divideres med absorbansværdien af den første standard (nul standard) og ganges med 100%.Nulstandarden er således gjort lig med 100%, og absorbansværdierne er angivet i procenter.
B
Absorbans (%) = —— ×100 %
B0
B - Absorbansstandard (eller prøve)
B0 ——absorbans nul standard
10.2 Standardkurve
---- For at tegne en standardkurve: Tag absorbansværdien af standarder som y-akse, semilogaritmisk af koncentrationen af tylosinstandardopløsningen (ppb) som x-akse.
----Tylosinkoncentrationen af hver prøve (ppb), som kan aflæses fra kalibreringskurven, multipliceres med den tilsvarende fortyndingsfaktor for hver prøve, som følges, og den faktiske koncentration af prøven opnås.
Bemærk venligst:
Der er udviklet en særlig software til dataanalyse, som kan leveres på forespørgsel.
11. Følsomhed, nøjagtighed og præcision
Testfølsomhed:1,5 ppb
Detektionsgrænse:
Dyrevæv………………………….…………………1.5ppb Mælk…………………………………………………………………..15ppb Nøjagtighed:
Dyrevæv………………………………………………80±15 %
Mælk…………………………………………..……….……80±10 %
Præcision:
Variationskoefficienten for ELISA-kittet er mindre end 10 %.
12. Meddelelse
12.1 Middelværdierne af absorbansværdierne opnået for standarderne og prøverne vil blive reduceret, hvis reagenserne og prøverne ikke er blevet reguleret til stuetemperatur (20-25℃).
12.2 Lad ikke mikrobrønde tørre mellem trinene for at undgå mislykket reproducerbarhed, og udfør det næste trin umiddelbart efter at have banket på mikrobrøndholderen.
12.3 Ryst hvert reagens forsigtigt før brug.
12.4 Hold din hud væk fra stopopløsningen, for den er 0,5MH2SO4løsning.
12.5 Brug ikke sættene forældede.Udskift ikke reagenserne fra forskellige batches, ellers vil det falde følsomheden.
12.6 Opbevar ELISA-sættene ved 2-8 ℃, frys ikke.Forsegl hvile mikrobrønds plader. Undgå direkte sollys under alle inkubationer.Det anbefales at dække mikrotiterpladerne.
12.7 Substratopløsningen bør opgives, hvis den får farve.Reagenserne kan blive dårlige, hvis absorbansværdien (450/630nm) af nulstandarden er mindre end 0,5 (A450nm<0,5).
12.8 Farvningsreaktionen behøver 15 minutter efter tilsætning af opløsning A og opløsning B. Og du kan forlænge inkubationstiden til 20 minutter eller mere, hvis farven er for lys til at kunne bestemmes.Overskrid aldrig 30 minutter, tværtimod, forkort inkubationstiden ordentligt.
12.9 Den optimale reaktionstemperatur er 37℃.Højere eller lavere temperatur vil føre til ændringer af følsomheds- og absorbansværdier.
13. Opbevaring
Opbevaringstilstand: 2-8 ℃.
Opbevaringstid: 12 måneder.
