Kit d'immunoassay enzimaticu cumpetitivu per l'analisi quantitativa di tilosina
Kit di immunoanalisi enzimatica competitiva per
Analisi quantitativa diTilosina
1. Sfondate
Tilosinahè un antibioticu macrolide, chì hè principalmente appiicatu cum'è antibacterial è anti-mycoplasma.L'MRL stretti sò stati stabiliti postu chì sta droga pò purtà à un effettu seriu in certi gruppi.
Stu kit hè un novu pruduttu basatu nantu à a tecnulugia ELISA, chì hè veloce, faciule, precisu è sensibile cumparatu cù l'analisi strumentale cumuni è solu bisognu di 1,5 ore in una operazione, pò minimizzà considerablemente l'errore di l'operazione è l'intensità di u travagliu.
2. Principiu di prova
Stu kit hè basatu annantu à a tecnulugia ELISA cumpetitiva indiretta.I pozzi di microtitre sò rivestiti cù l'antigenu di accoppiamentu.U residu di Tylosin in a mostra compite cù l'antigenu rivestitu nantu à u microtiter plate per l'anticorpu.Dopu l'aghjunzione di l'anticorpu marcatu di l'enzima, u sustrato TMB hè utilizatu per vede u culore.Absorbance di u campionu hè negativu ligata à u tylosin residu in lu, dopu à paragunà cù u Standard Curve, multiplicate da u fattore dilution, quantità residue tylosin in u campionu pò esse calculatu.
3. Applicazioni
Stu kit pò esse usatu in l'analisi quantitativa è qualitativa di u residu di tylosin in tissuti animali (pollu, porcu, anatra) è latti, meli, ovu, etc.
4. Cross-reazzioni
Tilosina…………………………………………………… ..100%
Tilmicosin……………………………………………<2%
5. Materiali Required
5.1 Equipaggiamenti:
---- Spettrofotometru di piastra di microtitru (450nm / 630nm)
----Evaporatore rotativu o strumenti d'asciugatura di nitrogenu
----omogenizatore
---- Shaker
----Centrifuga
---- Bilanciu analiticu (induttanza: 0,01 g)
----Pipetta graduata: 10 ml
----Ampoule à pipette en gomma
----Fiaschetta volumetrica: 10 ml
---- Tubi da centrifuga in polistirene: 50 ml
----Micropipette: 20-200ml, 100-1000ml
250 ml-multippette
5.2 Reagenti:
----Idrossidu di sodiu (NaOH, AR)
---- Bicarbonate de sodium (NaHCO3,AR)
---- Carbonate di sodiu (NaCO3, AR)
----Acidu trichloroaceticu (AR)
---- Acetonitrile (AR)
----Acetate d'etile (AR)
┅┅n-esano (AR)
---- Acqua deionizzata
6. Kit cumpunenti
l Piastra di microtitru cù 96 pozzi rivestiti cù antigenu
l Soluzioni standard (5 buttigli, 1 ml / bottiglia)
0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13,5 ppb
l Spiking standard di cuntrollu: (1 ml / buttiglia)1 ppm
l Enzyme conjugate 1ml……………..…..…cap rosso
l Soluzione d'anticorpi 7ml……………….……cap verde
l Soluzione A 7ml…………………………….….……capu biancu
l Soluzione B 7ml………………………………..cappu rossu
l Stop solution 7ml.……………….……….capu giallu
l 20 × suluzione di lavà cuncentrata 40ml
…………………………………………..…capu trasparente
l 4 × suluzione d'estrazione cuncentrata 50ml
……………………………………………….capu turchinu
7. Preparazione di reagenti:
Soluzione 1:Soluzione di NaOH 0,1 mol/L
Pesa 0,4 g NaOH à 100 ml d'acqua deionizzata è mischjà completamente.
Soluzione 2: 1 mol/L di soluzione NaOH
Pesa 4 g NaOH à 100 ml d'acqua deionizzata è mischjà completamente.
Soluzione 3: Carbonate buffer sale
Soluzione1: 0,2 M PB
Dissolve 51,6 g di Na2HPO4· 12 ore2O, 8,7 g di NaH2PO4· 2 ore2O cun acqua deionized è dilute à 1000 ml.
Soluzione2: suluzione d'estrazzioni
Dilute a suluzione di estrazione 2 × cuncentrata cù acqua deionizzata in u rapportu di voluminu di 1: 1 (p.e. 10 ml di 2 × suluzione d'estrazione + 10 ml d'acqua deionizzata), chì serà utilizatu per l'estrazione di campioni,sta suluzione pò esse guardatu à 4 ℃ per 1 mese.
Soluzione3: Lavà suluzione
Dilute a suluzione di lavaggio 20 × cuncentrata cù acqua deionizzata in u rapportu voluminu di 1: 19 (p.e. 5 ml di suluzione 20×lavare + 95 ml d'acqua deionizzata), chì serà utilizatu per lavà i piatti.Sta suluzione pò esse guardata à 4 ℃ per 1 mese.
8. Sample Preparations
8.1 Avvisu è precautions prima di l'operazione:
(a) Per piacè aduprate punte una volta in u prucessu di l'esperimentu, è cambiate i cunsiglii quandu assorbe diversi reagenti.
(b) Assicuratevi chì tutti i strumenti sò puliti.
(c) Mantene a mostra di tissutu in freeze.
(d) A mostra preparata deve esse usata per l'assay à una volta.
8.2 Tessuti animali (pollu, porcu, etc.)
---- Homogenize a mostra cù homogenizer;
---- Pigliate 2,0±0,05 g di homogenate in un tubu di centrifuga di polistirene da 50 ml;aghjunghje 2ml di 0.2M PB (suluzione1), scuzzulate per dissolve, è dopu aghjunghje 8ml di acetate d'etile è agitate ferocemente per 3min;
----Centrifuga per a separazione: 3000g / temperatura ambiente / 5min.
---- Trasferisce 4 ml di a fase organica supernatante in un tubu di vetru di 10 ml, secca cù un bagnu d'acqua à 50-60 ℃ sottu u flussu di gasu di nitrogenu;
----Dissolve u restu seccu cù 1 ml di n-hexane, vortex per 30 s per dissolve, è dopu aghjunghje 1 ml di suluzione d'estrazione (suluzione2), vortex per 1 min.centrifuga per a separazione: 3000g / temperatura ambiente / 5min
----Eliminà a fase n-hexane supernatant;piglià 50 μl di a fase aquosa di sustrato per l'analisi.
Fattore di diluzione: 1
8.2 Latti
----Pigliate 100μl di campione di latte crudo, mischjà cù 900μl di suluzione d'estrazione (suluzione2), è mischjà completamente.
----Pigliate 50μl di a suluzione preparata per l'analisi.
Fattore di diluzione: 10
9. Prucessu d'assay
9.1 Avvisu prima di analisi
9.1.1Assicuratevi chì tutti i reagenti è i microwells sò tutti à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃).
9.1.2Ritorna tutti i reagenti di u restu à 2-8℃subitu dopu usatu.
9.1.3Lavà i microwells currettamente hè un passu impurtante in u prucessu di analisi;hè u fattore vitale per a riproducibilità di l'analisi ELISA.
9.1.4 Aannullà a luce è copre i microwells durante l'incubazione.
9.2 Passi di analisi
9.2.1 Pigliate tutti i reagenti à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃) per più di 30 min, scuzzulate delicatamente prima di l'usu.
9.2.2 Scuprite i micropozzi necessarii è rinviate u restu in u saccu zip-lock à 2-8 ℃ immediatamente.
9.2.3 A suluzione di lavare diluted deve esse rinfriscata per esse à a temperatura di l'ambienti prima di l'usu.
9.2.4numeru:Numerate ogni pusizioni di micropozzetti è tutti i standard è i campioni duveranu esse eseguiti in duplicatu.Registrate i standard è e pusizioni di campioni.
9.2.5Add suluzione standard / campione è suluzione di anticorpi: Aggiungere 50 µl di soluzione standard ((kit furnitu)) o campione preparatu à i pozzi currispundenti.Aggiungere 50 µl di soluzione di anticorpi (kit furnitu).Imbulighjate delicatamente scuzzulate a piastra manualmente è incubate per 30 minuti à 37 ℃ cù a tappa.
9.2.6Lavà: Retirer délicatement le couvercle et purifier le liquide des puits et laver les micropoits avec 250 µl de solution de lavage diluée (suluzione3) à intervallu di 10s per 4-5 volte.Assorbe l'acqua residuale cù carta assorbente (a bolla di l'aire di restu pò esse eliminata cù una punta inutilizata).
9.2.7Aghjunghjite l'enzyme conjugate: Aggiungi 100 ml di soluzione di coniugati enzimatici (kit furnitu) à ogni pozzu, mischjà delicatamente è incubate per 30 min à 37 ℃ cù una coperta.Repetite u passu di lavatu di novu.
9.2.8Culorazione: Ajouter 50 µl de solution A(kit furnitu) e 50 µl di soluzione B(kit furnitu) à ogni pozzu.Imbulighjate delicatamente è incubate per 15 minuti à 37 ℃ cù una coperta.
9.2.9Misura: Ajouter 50 µl de solution stop (kit furnitu) à ogni pozzu.Imbulighjate delicatamente è misurà l'assorbanza à 450nm (Hè suggeritu misura cù a doppia lunghezza d'onda di 450 / 630nm. Leghjite u risultatu in 5min dopu l'aghjunghje a suluzione di stop).
10. Risultati
10.1 Assorbanza percentuale
I valori medii di i valori di assorbanza ottenuti per i standard è i campioni sò divisi da u valore di assorbanza di u primu standard (standard zero) è multiplicate da 100%.U standard zero hè dunque fattu uguali à 100% è i valori di assorbanza sò citati in percentuali.
B
Assorbanza (%) = —— × 100%
B0
B - standard di assorbanza (o campione)
B0 ——assorbanza zero standard
10.2 Standard Curve
----Per disegnà una curva standard: Pigliate u valore di assorbanza di i standard cum'è l'asse y, semi-logaritmica di a cuncentrazione di a suluzione standard di tilosina (ppb) cum'è l'assi x.
---- A cuncintrazione di tylosin di ogni mostra (ppb), chì pò esse lettu da a curva di calibrazione, hè multiplicata da u fattore Dilution currispundente di ogni mostra seguita, è a cuncentrazione attuale di mostra hè ottenuta.
Per piacè nutate:
Un software speciale hè statu sviluppatu per l'analisi di dati, chì pò esse furnitu nantu à dumanda.
11. Sensibilità, accuratezza è precisione
Sensibilità di prova:1,5 ppb
Limite di rilevazione:
Tessutu animali……………………………………… 1,5 ppb Latti……………………………………………………………………..15 ppb Precisione:
Tessuti animali ……………………………………… 80 ± 15%
Latte…………………………………..……….……80±10%
Precisione:
U coefficient di variazione di u kit ELISA hè menu di 10%.
12. Avvisu
12.1 I valori medii di i valori di assorbanza ottenuti per i standard è i campioni seranu ridotti se i reagenti è i campioni ùn sò micca stati regulati à a temperatura di l'ambienti (20-25 ℃).
12.2 Ùn permettenu micca chì i micropozzi si seccanu trà i passi per evità una riproducibilità senza successu è operate u passu prossimu immediatamente dopu à toccu u titularu di i micropozzi.
12.3 Agite ogni reattivu delicatamente prima di l'usu.
12.4 Mantene a vostra pelle luntanu da a suluzione di stop perchè hè 0.5MH2SO4suluzione.
12.5 Ùn aduprate micca i kit obsoleti.Ùn scambiate micca i reagenti di diversi lotti, altrimenti abbandunà a sensibilità.
12.6 Mantene i kit ELISA à 2-8 ℃, ùn congelate micca.Sigillate i piatti di micropozzetti di riposu, Evite a luce diretta di u sole durante tutte l'incubazioni.Hè ricumandemu di copre i platti di microtitre.
12.7 A suluzione di u sustratu deve esse abbandunatu s'ellu cambia i culori.I reagenti ponu esse girati male se u valore di assorbanza (450/630nm) di u standard zero hè menu di 0.5 (A450nm <0.5).
12.8 A reazione di colorazione hà bisognu di 15min dopu l'aghjunzione di a suluzione A è a suluzione B. È pudete allargà u tempu d'incubazione varieghja à 20min o più se u culore hè troppu chjaru per esse determinatu.Ùn mai più di 30min, à u cuntrariu, accurtà u tempu d'incubazione bè.
12.9 A temperatura di reazione ottima hè 37 ℃.A temperatura più alta o più bassa porta à i cambiamenti di i valori di sensibilità è di assorbanza.
13. Storage
Cundizione di almacenamentu: 2-8 ℃.
Periudu di almacenamiento: 12 mesi.
